T-GXAS 489-2023 非洲豬瘟病毒、豬瘟病毒和豬非典型瘟病毒鑒別檢測(cè) 多重RT-PCR和多重qRT-PCR法

GXASI本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定1非洲豬瘟病毒、豬瘟病毒和豬非典型瘟病毒鑒別檢測(cè)多重RT-PCR和多重qRT-PCR法本文件規(guī)定了用于鑒別檢測(cè)非洲豬瘟病毒、豬瘟病毒和豬非典型瘟病毒的多重RT-PCR和多重qRT-PCR法，包括原理、試驗(yàn)條件、試劑、主要儀器設(shè)備、樣品采集與處理、多重RT-PCR檢測(cè)、多重NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范ASFV：非洲豬瘟病毒（AfricanSwCSFV：豬瘟病毒（ClassicalSwineFeverAPPV：豬非典型瘟病毒（AtypicalPorcRT：反轉(zhuǎn)錄（ReverseTranscripPCR：聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReactiRT-PCR：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（ReverseTranscriptionPolymerqRT-PCR:實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（QuantitativeRealCt值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)量達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Cyc4.2根據(jù)ASFV、CSFV和APPV基因特定序列的保守片段，合成2應(yīng)按照普通PCR儀和實(shí)時(shí)熒光PCR儀的不同儀器型號(hào)選取合適的PCR和qRT-PCR擴(kuò)增試劑。宜選取商品化的反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑豬口鼻拭子、血清、全血、組織、環(huán)境拭子等樣品采集按NY/取200μL待檢樣品于無(wú)RNA酶的1.5mL離心管中，按照RNA/DNA提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)抽提總9.1.2加完試劑后瞬時(shí)離心混勻。將PCR39.2.1反應(yīng)體系的配制加完試劑后瞬時(shí)離心混勻。將PCR反應(yīng)管置于普通PCR儀內(nèi)，設(shè)置如下反應(yīng)參數(shù)：94℃2min；用重組質(zhì)粒p-ASFV、p-CSFV和p-APPV混合物作為陽(yáng)性對(duì)照，重組質(zhì)粒的制備方法見(jiàn)附錄C。412.1.2.1當(dāng)陰性對(duì)照無(wú)任何擴(kuò)增帶，而陽(yáng)性對(duì)照在12.1.2.2若被檢樣品在828bp位置出現(xiàn)擴(kuò)增帶，判定為ASFV陽(yáng)12.1.2.4若被檢樣品在275bp位置出現(xiàn)擴(kuò)增帶，判定為AP根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線(xiàn)剛好超過(guò)正5ASFV-FAGGGGTTTGAGGTCCATTAASFV-RAPPV-FAPPV-RATCCGCCGGCACTCTATCAAG6ASFV-p72-FGGCGTATAAAAAGTCCAGGAAAASFV-p72-RASFV-p72-PTexasRed-TCACCAAATCCTTTTGCGATGCAAGCT-BCCTGAGTACAGGACAGTCGTJOE-TTCGACGTGAGCAGAAGCCCACC-APPV-5'UTR-FAPPV-5'UTR-RGGCACTCTATCAAGCAGTAAGGTAPPV-5'UTR-PFAM-TCGGGTCCACCATGCCCCTT