(高清版)DB22∕T 1978-2013 野鯉種質(zhì)鑒定 微衛(wèi)星法　

野鯉種質(zhì)鑒定微衛(wèi)星法2013-12-18發(fā)布2013-12-31實(shí)施吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省水利廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：鄭偉、閆春梅、毛瑞鑫、陳偉強(qiáng)、王戰(zhàn)蔚、王文蘭、杜曉燕、李忠強(qiáng)、李秀穎、常淑芳、李永利。14原理5試劑25.2無水乙醇。5.4TaqDNA聚合酶：-20℃保存。5.5分子量標(biāo)準(zhǔn)(Markers):DL2000。5.6溴化乙錠(EB)。5.9300g/L丙烯酰胺溶液：20mL水中融解29g丙烯酰胺，1g甲叉雙丙烯酰胺，定容至100mL,4℃5.105×Tris硼酸(5×TBE)電泳緩沖液：Tris27g,硼酸13.75g,加蒸餾水400mL溶解后，加入0.55.11100g/L過硫酸銨：8mL水中溶解1g過硫酸銨，加水至10mL,4℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。5.121g/L硝酸銀(AgNO?)染色液：將AgNO?0.5g溶于超純水450mL,加ddH?O定容至500mL,5.13裂解液：5g/L十二烷基肌胺酸鈉，10mmol/LEDTA(5.15提取液：Tris飽和酚+氯仿+異戊醇(25+24+1,體積比)。5.16乙醇溶液：乙醇+水(7+3,體積比)。5.20微衛(wèi)星引物：參見附錄A。6儀器6.1電子天平：精度0.0001g。6.4水浴恒溫震蕩器：溫控范圍RT-100℃,控溫精度±1℃。6.8凝膠成像分析系統(tǒng)。38試驗(yàn)步驟取20mg鰭條加入0.6mL裂解液，55℃溫育1-2h,并不時(shí)輕搖至組織塊完全消化，取上清液用提取液抽提3次，加入無水乙醇1ml于-20℃過夜沉淀，離心，棄去上清液，再用0℃預(yù)冷的乙醇溶液洗滌1次，自然干燥后加50-100μL1×TE(pH8.0)溶解DNA,4℃保存?zhèn)溆谩?.2.1DNA純度測(cè)定吸取1-3μL提取的DNA,用濃度10-20g/L瓊脂糖凝膠100V電泳30min,檢測(cè)所提取DNA的質(zhì)量。以DNA條帶的分子量及有無拖尾為標(biāo)準(zhǔn)判斷DNA的質(zhì)量。分別于260nm波長和280nm波長下測(cè)定產(chǎn)物(或產(chǎn)物稀釋液)的紫外吸收值。確定Azgo/A?s比值在1.8-2.0范圍內(nèi)，方可正常進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。8.2.2DNA濃度測(cè)定取適量8.2.1測(cè)定后產(chǎn)物，于260nm波長測(cè)定紫外吸收值，并根據(jù)公式(1)計(jì)算產(chǎn)物DNA濃度。L比色池厚度，單位為厘米(cm);稀釋倍數(shù)檢測(cè)前DNA吸光度值達(dá)到允許范圍0.1-0.8時(shí)所需要稀釋的倍數(shù)。8.3微衛(wèi)星引物配制取附錄A所列17種微衛(wèi)星引物用水配制成濃度為50pmol溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?.4.1PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體積均為15μL,PCR反應(yīng)體系組成見表1。4反應(yīng)體系正向引物(2pmol/μL)反向引物(2pmol/μL)8.4.2PCR反應(yīng)程序表2微衛(wèi)星標(biāo)記——PCR反應(yīng)程序階段溫度時(shí)間1230個(gè)循環(huán)348.5PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)58.5.3制膠將配制的52mL300g/L丙烯酰胺溶液中加入40mL5×TBE和107mL蒸餾水，15μLTEMED,用攪棒混勻溶液(不得有氣泡),將制好的膠板斜放45度角，然后用玻棒引流緩緩灌緩慢移去膠板底端的塑料封口槽，將膠板帶凹口面向內(nèi)裝到電泳槽上，用彈簧夾夾緊膠模。用1×加完后，在預(yù)留的樣品槽點(diǎn)入DL2000markers,將電源連接，120V恒壓電泳。當(dāng)指示劑跑到膠板底部時(shí)，結(jié)束電泳，將電源電壓調(diào)至為“O”,再關(guān)閉電源開關(guān)。取下凝膠板心去掉膠板兩側(cè)的隔板后在蒸餾水中輕輕撬開兩片玻璃板取下凝膠，用蒸餾水洗膠30s,再將凝膠置于1g/L硝酸銀染色液中染色10min,型(如AA,AB,AC或BB等),建立各個(gè)群體的等位基因型數(shù)據(jù)陣列。8.7.2結(jié)果分析利用群體遺傳學(xué)分析軟件