丙氨酸氨基轉移酶(ALT)測定課件

血清谷—丙轉氨酶活性的測定（改良賴氏法）【目的要求】1.掌握血清谷丙轉氨酶活性測定的基本原理。2.熟悉血清谷丙轉氨酶活性測定的具體操作方法。3.了解血清谷丙轉氨酶活性測定的臨床意義?！緦嶒炘怼垦逯械墓?丙轉氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的條件下，可催化基質（底物）液中的丙氨酸與α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：生成的丙酮酸可與起終止和顯色作用的2,4二硝基苯肼發(fā)生加成反應，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，進而在堿性環(huán)境中生成紅棕色的苯腙硝醌化合物，其顏色的深淺在一定范圍內與丙酮酸的生成量，亦即與ALT活性的高低成正比關系。據(jù)此與同樣處理的丙酮酸標準液相比較，便可算出或通過標準曲線查出血清中ALT的活性。

盡管基質液中余下的a-酮戊二酸同樣可生成紅棕色苯腙硝醌化合物而影響測定結果，但因其量不多，加之對505nm的吸光度遠不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物強，尤其用標準曲線作測定時，所用的酶活性單位通過卡門氏分光光度速率法矯正，擯棄了賴氏法一些固有弊端，結果比其他比色法準確。故衛(wèi)生部臨檢中心建議國內無條件使用連續(xù)監(jiān)測法的單位使用賴氏法。1981年全國常規(guī)生化檢驗方法學術討論會認為賴氏法測定ALT活性較為合理，全國肝炎協(xié)作會議也建議統(tǒng)一使用改良賴氏法?！痉椒ㄔu價】ALT活性測定主要有兩類。一是卡門氏（Karman）分光光度法，測定的是酶促反應速率。其原理如下：由于NADH在波長340nm處有特異吸收峰，因此ALT的活性可通過NADH的減少量，亦即通過340nm吸光度的減少量間接作出定量測定。這一方法特異性、準確性高。但是此法除要加入待測酶ALT的底物外，還需要加入指示酶LDH及其輔酶NADH，又需用紫外分光光度計，因此不易為一般臨床化驗室推廣。二是比色測定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun法）和賴氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、試劑、操作步驟及作用溫度等完全相同。不同之處在于作用時間：King法60min，Mohun法和Reiman法30min。因此它們的單位定義和標準曲線制備也不同。King法單位定義是：每1ml血清在37℃條件下與底物作用60min，生成1μmol丙酮酸稱為一個單位。Mohun法單位定義是：每毫升血清在pH=7.4，37℃條件下與底物作用30min，每生成2.5微克丙酮酸為1單位。賴氏法沒有制定自身的單位定義，而是以實驗數(shù)據(jù)套用速率法的卡門氏單位作表示的。1個卡門氏單位的定義是：在溫度25℃，pH7.4，波長340nm，光徑1cm的條件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的轉氨酶活性?？梢娍ㄩT氏單位不是用物質的量濃度，而是用物質的吸光度表示酶的活性單位的。若將卡門氏單位的定義條件代入國際單位計算公式，即得卡門氏單位與國際單位的換算關系：1卡門氏單位=0.4821IU/L(25℃)，便可將卡門氏單位兌換成國際單位。改原賴氏法的反應溫度(40℃改為37℃)和底物濃度(改為低濃度)的改良賴氏法，對卡門氏單位的科學套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其結果與速率法較為一致，能較好反映酶的真實活性。由于賴氏法設計的底物濃度,如a-酮戊二酸不足，反應速度只能達到最大速度的65%；顯色劑2,4-二硝基苯肼的用量只及反應液中酮酸濃度的一半；保溫30min的酶促反應后，新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在著無法人為控制的競爭顯色的幾率問題，如此等等，使賴氏法的重現(xiàn)性較差，在測量精度上仍與連續(xù)監(jiān)測法相差甚大?！九R床意義】肝細胞中含ALT最豐富，因此當肝臟疾病致肝細胞受損傷時，ALT即大量釋放入血液，致使血清中ALT活性增高。測定ALT是檢查肝功能的重要指標之一。ALT顯著增高見于各種急性肝炎及藥物中毒性肝細胞壞死，中等程度增高見于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，輕度增高則見于阻塞性黃疸及膽道