飼料中免疫球蛋白IgG的測定 高效液相色譜法 征求意見稿

1GB/T21033－202×飼料中免疫球蛋白IgG的測定高效液相色譜法本文件描述了飼料中免疫球蛋白IgG的高效液相色譜測定方法。本文件適用于配合飼料、濃縮飼料、寵物飼料和飼料原料（包括血漿蛋白粉等）中免疫球蛋白IgG的測定。本文件的定量限為5mg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法GB/T20195動物飼料試樣的制備3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理根據(jù)高效親和色譜的原理，在磷酸鹽緩沖液條件下免疫球蛋白IgG與配基連接，在pH2.5的鹽酸甘氨酸條件下洗脫免疫球蛋白IgG。5試劑和材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。5.1水：GB/T6682，一級。5.2流動相A：稱取磷酸二氫鉀3.4g和磷酸氫二鉀4.6g，用水溶解并定容至1000mL，混勻。調(diào)節(jié)溶液pH6.5。5.3流動相B：稱取甘氨酸3.8g，加入300mL水，攪拌并滴加3.0mL鹽酸，溶解后定容至1000mL，混勻。調(diào)節(jié)溶液pH2.5。5.4IgG儲備標(biāo)準(zhǔn)液：稱取IgG標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）0.0100g，用流動相A（5.2）溶解并定容至10.0mL，搖勻，濃度為1.0mg/mL。5.5IgG工作標(biāo)準(zhǔn)溶液：取IgG標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用流動相A（5.2）稀釋成含IgG0.1、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，臨用現(xiàn)配。5.6微孔濾膜：0.45μm，水系。2GB/T21033－202×6儀器和設(shè)備6.1高效液相色譜儀：具紫外檢測器和梯度洗脫裝置。6.2分析天平：精度0.0001g。6.3pH計。6.4勻漿機。6.5離心機。7樣品按GB/T20195制備樣品，至少200g，粉碎使其全部通過1.0mm孔徑的分析篩，充分混勻，裝入磨口瓶中，保存，備用。8試驗步驟8.1試樣處理平行做兩份試驗。稱取一定量試樣（精確至0.0001g），配合飼料、濃縮飼料、寵物飼料稱取試樣2～10g；血漿蛋白粉稱取試樣0.1g；濃縮乳清蛋白粉稱取試樣0.5g。于茄形瓶中，加入正己烷1mL，準(zhǔn)確加入25.0mL流動相A（5.2用勻漿機勻漿5min，取溶液10mL于離心管中，以3500r/min離心10min，過0.45μm微孔濾膜備用。8.2測定8.2.1液相色譜參考條件液相色譜參考條件如下：a）色譜柱：PharmaciaHI-TrapProteinG柱，1mL；b）梯度洗脫條件：梯度洗脫程序見表1，先用5倍柱體積的重蒸餾水或去離子水洗柱，再用10倍柱體積流動相A（5.2）平衡柱，按洗脫程序進行洗脫；c）流速：0.5mL/min；d）進樣量：20μL；e）紫外檢測波長：280nm。表1梯度洗脫程序時間（min）流速（mL/min）流動相A（%）流動相B（%）00.504.50.505.50.500.500.5026.00.508.2.2標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液測定在儀器的最佳條件下，分別取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（5.5）和試樣溶液（8.1）上機測定。IgG標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖見附錄A。3GB/T21033－202×8.2.3定性以保留時間定性，試樣溶液中IgG保留時間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（濃度相當(dāng)）中IgG的保留時間一致，其相對偏差在±2.5％之內(nèi)。8.2.4定量以IgG的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（響應(yīng)值）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99。試樣溶液中IgG的濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。如超出范圍，應(yīng)將試樣溶液用流動相A（5.2）稀釋后，重新測定（或重新試驗）。單點校準(zhǔn)定量時,試樣溶液中IgG的濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相差不超過30%。9試驗數(shù)據(jù)處理試樣中IgG的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w計，數(shù)值以毫克每千克（mg/kg）表示。多點校準(zhǔn)按公式（1）計算；單點校準(zhǔn)按公式（2）計算：……………………式中:ρ——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的試樣溶液IgG的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升（mg/mLV——提取溶液的體積，單位為毫升（mL）；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）?！街校篈——試樣溶液中IgG色譜峰面積；As——標(biāo)準(zhǔn)溶液中IgG的峰面積；ρs——標(biāo)準(zhǔn)溶液中IgG的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升（mg/mLV——試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mL）；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。平行測定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留小數(shù)點后兩位有效數(shù)字。10精密度在重