DB33T 594-2017 草莓脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程　

DB33代替DB33/594.1-2005,DB33/T594.Technicalregulationforvirus-freeplantletsofstrawberry浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)代替DB33/594.1-2005《草莓脫毒種苗第1部分：脫毒種苗》和DB33/T594.2-2005《草莓脫毒種苗第2部分：生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》，本標(biāo)準(zhǔn)以DB33/594.1-2005為主，整合了DB33/T594.2-2005的部分內(nèi)容，與DB33/594.1-2005相比，除編輯性修改外──修改了草莓脫毒苗、脫毒組培瓶苗、脫毒原種苗等術(shù)語(yǔ)和定義（見(jiàn)3，2005年版的3）；──增加了生產(chǎn)技術(shù)（見(jiàn)4──修改了脫毒種苗的脫毒檢測(cè)方法（見(jiàn)附錄A，2005年版的61草莓脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程草莓輕型黃邊病毒（Strawberrymildyellowedgevirus，SMYEV）、草莓鑲脈病毒（Strawberryveinbandingvirus，SVBV）和草莓皺縮病毒（Strawberryc原種苗、脫毒原種苗及脫毒生產(chǎn)用苗。NY/T401-2000脫毒馬鈴薯種薯（苗）病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程SN/T2122進(jìn)出境植物及植物產(chǎn)24生產(chǎn)技術(shù)4.1脫毒組培瓶苗生產(chǎn)技術(shù)4.1.1外植體選擇4.1.2無(wú)菌苗繁育匍匐莖段經(jīng)無(wú)菌水清洗后置于超凈工作臺(tái)，切取帶生長(zhǎng)洗表面30s,然后經(jīng)次氯酸鹽和Tween-20消毒8min～10min，并不斷搖動(dòng)，最后用無(wú)菌水沖洗5次～8次，用無(wú)菌濾紙吸干水分，剝?nèi)?.5mm～1.0mm的莖尖分生組織，接種于誘導(dǎo)不定芽4.1.3脫毒苗培育4.1.4脫毒苗快繁經(jīng)病毒檢測(cè)合格的試管苗，接種到增殖培養(yǎng)基中，增殖4.1.5培養(yǎng)條件培養(yǎng)。每天照光12h～14h。4.2脫毒原原種苗、脫毒原種苗和脫毒生產(chǎn)用苗生產(chǎn)技術(shù)4.2.1脫毒原原種苗生產(chǎn)4.2.2脫毒原種苗繁殖34.2.2.1苗床準(zhǔn)備草莓忌連作，選用前作為稻或休閑空地作專(zhuān)用種苗地繁育。定植前施足基肥，每667m2（畝）施入腐熟的有機(jī)肥2000kg，氮、磷、鉀（15%:15%:15%）三元復(fù)合肥20kg。苗地按畦寬1.2m～1.5m(溝寬4.2.2.2定植方式種性純正的脫毒原原種苗定植在畦中間，株距100cm～150c4.2.2.3栽培管理4.2.3脫毒生產(chǎn)用苗繁殖4.2.3.1苗床準(zhǔn)備草莓忌連作，選用前作為稻或休閑空地作專(zhuān)用種苗地繁育。定植前施足基肥，每667m2（畝）施入腐熟的有機(jī)肥2000kg，氮、磷、鉀（15%:15%:15%）三元復(fù)合肥20kg。苗地按畦寬1.2m～1.5m(溝4.2.3.2定植方式種性純正的脫毒原種苗定植在畦中間，株距14.2.3.3栽培管理5.1脫毒苗按繁育過(guò)程可分為脫毒組培瓶苗、脫毒原原種苗、脫毒原種5.2脫毒組培瓶苗按質(zhì)量要求分為優(yōu)質(zhì)苗和合格苗。4脫毒組培瓶苗、脫毒種苗的質(zhì)量等級(jí)指標(biāo)、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則包裝箱內(nèi)附脫毒苗出廠（圃）合格證、病毒檢測(cè)報(bào)告（見(jiàn)附錄C外面應(yīng)注明標(biāo)準(zhǔn)號(hào)、生產(chǎn)單位運(yùn)輸過(guò)程中注意保溫保濕，溫度以15℃~30℃為宜，濕度以60%～90%為宜。8.4貯存5A.1雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(DAS-ELISA)檢測(cè)方法按NY/T401-2000中附錄A.2分子生物學(xué)聚合酶鏈檢測(cè)法(PCR)A.2.1草莓斑駁病毒草莓斑駁病毒是RNA病毒。取各編號(hào)株的葉片，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR檢測(cè)。利用引A.2.2草莓輕型黃邊病毒草莓輕型黃邊病毒是一種單鏈線形正義RNA病毒。取各編號(hào)株的葉片，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR檢測(cè)。利用引物（上游引物5’－GTGTGCTCAATCCAGCCAG－3’和下游引物5’-延伸45s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，擴(kuò)A.2.3草莓鑲脈病毒A.2.4草莓皺縮病毒-3’），94℃預(yù)變性3min后進(jìn)入循環(huán)：94℃變性30s，54℃退火40s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)，A.3.1檢測(cè)程序病葉浸蘸負(fù)染色法：用研缽將病葉組織充分研磨，組織汁液經(jīng)2%的磷鎢酸（pH值6.86A.3.2病毒顆粒特性A.3.2.1草莓斑駁病毒A.3.2.2草莓輕型黃邊病毒徑為13nm，長(zhǎng)度為470nm～580nm，分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。A.3.2.3草莓皺縮病毒為63nm～75nm，長(zhǎng)度為190nm～380nm，在植株表皮、導(dǎo)管和篩管附近的薄壁組織細(xì)胞內(nèi)均有分布。A.3.2.4草莓鑲脈病毒直徑為40nm～50nm，主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制，存在于葉片表皮與木質(zhì)部相連的導(dǎo)管和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。7脫毒組培瓶苗、脫毒種苗的質(zhì)量要求、檢測(cè)方法、檢測(cè)規(guī)則851142脫毒率，%種苗生長(zhǎng)健壯、三葉一心、根系發(fā)達(dá)、無(wú)外