PCR基礎(chǔ)知識資料

PCR實(shí)驗(yàn)操作程序

1.在無菌的0.5ml或0.2ml離心管中按下列操作程序加樣：

反應(yīng)物加樣順序體積（口1）終濃度

去離子水129.4

10XBufferB25IX

4XdNTP混合物35各200umol/L

MgCL431.5mmol/L

有義引物52.60.25ymol/L

反義引物62.60.25umol/L

模板720.1ug

TaqDNA聚合酶80.4lunit

2.用微量可調(diào)加樣器和一次性Tip向每一管中加50ul礦物油。每加一管換一次Tip。

3.振蕩每只管，然后短暫離心。

4.將管放到預(yù)熱的熱循環(huán)中，按下列程序開始循環(huán)：

預(yù)變性94℃4分鐘1次

變性94-C1分鐘

退火37-65c1分鐘

延伸72,C1分鐘

循環(huán)30次

終延伸72℃7分鐘1次

保存4c

5.將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析結(jié)果。電泳條件：60-80VJ5-20分鐘。

6.紫外分析儀檢查電泳結(jié)果。

四、討論

1.假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量，④PCR循環(huán)條件。尋

找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有Taq酶抑制劑，②在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。③模板核酸變性不徹

底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，有可能是模板核酸提取過程出了毛病，可使用陽性對照的DNA

模板配合檢查模板質(zhì)量。

酶失活：需更換新葡，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。

引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散

的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱

擴(kuò)增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看0D值，更要注重引物原液做瓊脂糖

凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條

帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物

時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失

效。④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2?濃度：隨2.離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影

響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR獷增采用的體積為20ul、30ul、50ul、或lOOul,應(yīng)用多大體積進(jìn)行

PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條

件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫

度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率，退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增

效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR

失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板

失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會成功的。

2.假陽性

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，擴(kuò)增出的

PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽性。

這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除

酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③

必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，

這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假

陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

3.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。

非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg"離子濃

度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異

條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：①必要時重新設(shè)計引物。

②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度

或采用二溫度點(diǎn)法（93*C變性，66P左右退火與延伸）。

4.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或函的質(zhì)量差，dNTP濃度過

高，Mg,‘濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②

減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg?.濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

測序常見問題及其分析

1、PCR產(chǎn)物測序時出現(xiàn)重疊峰

問題圖1（模板中有堿基缺失，往往是單一位點(diǎn)（1?1）或兩個位點(diǎn)（1-2）堿基缺失導(dǎo)致測序

結(jié)果移碼）

圖1?1

aCC；TGT.COTOCOCTTCNTTTTNGGNGGCCCTTOGGC

wwv.bbioo.con)

CAC-.TGCGTCGCG:GNCC:<^TTCGG7GGTG：-TTOTGCNXACGGGTGNT'-CVGTGGGC/XTCTGCCCTTC.CTC

333.bbioo.Gom

解決方法：將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒（如T教體）中挑單克隆測序，或?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE

純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測序。

問題圖2（PCR產(chǎn)物不純，含部分序列一致的兩種以上的片段，長度不一）

圖2

解決方法：主要原因是PCR產(chǎn)物沒有純化，含有部分序列一致的兩種以上長度不一的片段，將PCR產(chǎn)

物進(jìn)行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測序，便可解決。

問題圖3（測序引物有堿基缺失）

CTTANXCC；TNTMf.CTCN1TTNGCTTC-CCOTTGNGHKCMTCCCCNTTTCWTMTGQCWTCT

333.bbioo.con)

測序引物有堿基缺失（一般是引物的5端缺失），和模板的堿基缺失即圖1有些類似，所不同的是模板堿

基缺失一般是在一段正常測序序列后才出現(xiàn)移碼，而引物堿基缺失的話，則從測序一開始就出現(xiàn)移碼，表

面在圖形上便是一開始就是嚴(yán)重的峰形重登。

解決方法：重新合成引物，或?qū)⒁镞M(jìn)行PAGE純化

2、克隆測序時出現(xiàn)峰形重疊

ATCTGTTTTTTTTOTTGTGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTMCCCNNNCCN1NNTTMMTTT

RACE測序時經(jīng)常遇到圖4-1和圖4-4的情形，解決方法：從另一端測序：但如果這樣的序列出現(xiàn)在中

間，呵呵，目前還沒有很好的解決方法，要看測序公司的本事了。

C/Gcluster在PrV基因組測序時遇到過。后來還是讓TaKaRa公司給解決了，雖然不喜歡鬼子，但有

時候卻不得不用它們的產(chǎn)品和服務(wù)。

5、基因中含有重復(fù)序列

cccii:cc?ccciMCCc:'CCCT'?cccr*'CC€tcccrT?cccr>?ccc!'*ccc?Hfl-:i?JCCc:cccrAiccmccwccrc

www.bbioQ.com

可能的原因：樣品中含有重便序列導(dǎo)致的測序結(jié)果和PolyA/T的結(jié)果一樣，會導(dǎo)致Frame滑動，較短的

重徨序列會導(dǎo)致測序結(jié)果出現(xiàn)移碼：而較長的重便序列會使定序信號衰減。

解決辦法：反向測序有時能夠順利的通過重便序列區(qū)域（但不是一定都能夠），通過多次的測序結(jié)果比對，

拼接可以得到全序列結(jié)果。

PCR常見問題的精辟總結(jié)-耶魯大學(xué)

QUESTIONSSOLUTIONS

1.1get(many)longerunspecificDecreaM!aniKalingtime

products.WhalcanIdo?IncrcaM：annculingicmpcHUure

Decreaseextensiontime

Decreaseextensiontemperatureto62-68°C

IncreaseKCI(buflcr)concentrationto1,2x-2x.butkeepMgCI2concentrationat

liKrcascMgCI2coiKcntrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentration

constant.

Takelessprimer

TakelessDNAtemplate

TakelessTagpolymerase

Ifnoneof(heaboveworks:checktheprimerforrepdilivcsequences(BLAST

alignthesequencewiththedatabas^^)andchangeibeprimers)

Combinesome/alloftheabove

2.1get(many)shorterunspecificIncreaseannealingicmpcrMurc

products.WhatcanIdo?IncnsiM:annculinglime

Increaseextensiontime

Incf^a^eextension(en)peraiureto74-78°C

DecreaseKC1(buflfcr)concentrationtoO.7-O.8x.butkeepMgC12concentrationat

152mM

IncreaseMgCI2concoKrationupto3-4.5mMbulkeepdNTPconcentration

constani

Takelessprimer

TakelessDNAtemplate

TakeTaqpolymerase

Ifnoneof(heaboveworks:checktheprimerforrepetitivesequences(BLAST

alignthe陰uencewithibedatabases)3ndchangeibeprimerf^)

Combinesome/alloftheabove

3.Reactionwasworkingbefore,butnowMakesureallPCRingredknuaretakeninIbereaction(buffer,(emphie.Taq,etc)

Ican'<getanyproduct.ChangethedNTPsolution(verysensitivetocyclesofthawingandfreezing.

especiallyinmultiplexPCR)

Ifyoujustboughtnewprimers,checkfbr(heirrdiabiliiy(badprimersynthesis?)

primeranu)uni

Increase(emphteanKxml

Decreaseannealingicmpcraturcby6-IO^Candcheckifyougeta)yproduct.If

youdon't,checkallyourPCRingredienis.Ifyxxi<k)gelproducts(including

unspecificones)reactionconditionsasdescribedabove.

Combinesome/alloftbeabove

4.MyPCRproductisweak.IsthereaGraduallydecreasetheannealingtemperaturetothelowestpossible.

waytotheyield?(heanu)un<ofPCRprinter

Increase<hcamountofDNAtemplate

Increase(heamountofTaqpolymcras>c

Changebutter(KCI)oonccnlrudon(higherifproductixlowerthanlOOObpor

lowerifproductishigherchanlOOObp)

Addadjuvants.Best,useBSA(0.1io0.8pg.'pl.finalconcenlralkn).Youcanalno

try5%(v/v.Gnalconcentration)DMSOorglycerol.

Checkprimersequencesfbrmumaiche^and/orincreasetheprinwrlengthby5

nucleotides

Combineoftheabove

5.MytwoprimershaveverydiffcrcniAneasysolutionistoincreasethelengthoftheprimerwithlowIm.Ifyouneed(o

meltingteinperaiures(Tm)but1cannoikeepthesizeoftheproductconsunuaddafewba&esatthe3'end.Ifsizeisnoia

change(heirlocus.Whatcan1dotoconcern,addafewbasesateitherthe3'orthe5'endof(hatprim，.

improvePCRampliGcaiion?

6.1haveanumberofprimerpairsIVerylikely,yes.

wouldliketousetogether.Can1runaTryamplifyalllociseapracelyusingthesamePCRprogram.Ifoneoftheprimer

multiplexPCRwiththem?.Hou,?pairsyieldsunspecificproducts,keepthecyclingconditionsconstmtandchange

ocherparaineiers的mentionedabove(種1and#2%

Mixequimolaramountsofprimersandrunthemultiplexreactioneitherinthe

samecyclingconditionsorbydecreasingonlyiheamuraJingccmpeniturcby4°C.

Ifsomeof(belocian:weakornotamplified,n?dbelow!?

7.Howmanylocican1amplifyinDifficulttosay.Theauthorhasroutinelyamplifiedfrom2to14loci.

multiplexPCRatthesametime?Literaturedescribesupto25lociorso.

8.OneorafewlociinmymultiplexThefirstchoiceshouldbeincreasingibeamouniofprimerforthe?weak"locial

reactionarcveryweakorinvisible.Hovthesametimewithdecreasing(beamountofprimerforalllocithatcanbe

canamplifytltem?amplified.Thebalancebetweenthe&eamountsismoreimpoftanihanibeab&oluce

valuesused!!.

Cheekprimersequencesforprimcr-primcrinteractions

9.ShortPCRproductsinmymultiplexIncreaseKCI(bciflcr)conccntraiiontol.2x-2x.butkeepMgCI2concentrationat

reactionareweak.HowcanIimprovel3-2inM

(heiryield?DecrCiiM?denaturingtime

Decreaseannealingtimeandtemporalurc

Decreaseextensionlimeand(emperaturv

Incnc:ascamountofprimersfortheWwcak"lociwhiledecreasingticamountforthe

estrong'*loci.

Addadjuvants.Best,useBSA(0.1(o0.8pg/pLfinalconcoitraticn).Youoinalso

try5%(v/v.finalconcentration)DMSOorglycerol

Combine$omc/ulloftheabove

10.LongerPCRproductsinmyDeeres犍KC1(bufYer)conc€nirationio0.7-0.8x,butkeepMgCI2coiKenirationat

multiplexreactionarcweak.HowcanI1.5-2mM

improve(heiryield?Incn?seMgCI2concenirationupto3-4.5mMbutkeepdbJTPcoiicencration

conMant.

Increasedenaturingtime

IncnsiM：annealinglime

Decreaseannealingtemperature

Incmweexteiuion(iineandteinperaiure

Increaseamountofprimersforthe"weak"lociwhiledecreasinglieamountforthe

^rong"loci

Addadjuvants.B^suuseBSA(0.1to0.8pg.>pLfinalconcentraiicn).Youcanalso

tryyVtt(v/v,finalcooccntruoon)1>M5Uorglycerol

Combinesomc/alloftheabove

11.AilproductsinmymultiplexncactkoDccrcascannealinglimeinsmallsteps(2*C)

areweak.HowcanIimproveyield?Deceaseextennionteinperaiureio62-68°C

Increaseextension(imc

Increase(eniphtccoiKCiKration

IncreaseoverallprimercoiKcn(nition

AdjustTaqpolymeraseconcentration

ChangeKCI(bufYer)conceniraiion,butkeepMgCI2concentratiOBatl.5-2mM

IncreaseMgCI2coiKcntrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentration

conMani.

Addadjuvants.Best,useBSA(0.1(o0.8pg/pLfinalcofKcn(raticn).Youcanalso

try5%(v/v.Gnaiconceninuion)DMSOorglycerol

Combinesome/alloftheabove

12.UnspecificproductsappearinmyIflong:inct^suebuffercotKentraiioniol.2-2x.butkeepMgCI2a)i)cen(ruiion2H

multiplexreaction.CanIgetridofthem1.5-2mM

somehow?Ifshort:decre^ebufferconcetKrationco0.7-0.9x.bmkeepMgCI2conceniraiion

atl,5-2<nM

Graduallyincrease(heannealingtemperature

Decrease“mournof(cmplaic

Decreaseamountofprimer

Decreaseamountofenzyme

IncreaseMgCI2concoKrationupto3-4.5mMbulkeepdNTPconcentration

constant

AddudjuvanKBcM,useBSA(0.1lo0.8pg/pLfinalconceniralicn).Youcunalso

try5%(v/v.finaloonccntraiion)DMSOorglycerol

Ifnothingworks:mnPCRreactionsforeach(multiplexed)locu%individually,

usinganannealingtemperaturelowerthanusual.Comparetheunspecificpcoduds

foreachlocustestedwiththeunspecificproducts犍enwhenrunnngihemultiplex

PCR.Thismayindicatewhichprimerpairyieldstheunspccifkproductsinthe

multiplexreaction.

CombineM>mc/alloftheabove

(Note:primer-primerinteractionsinmultiplexPCRarcusuallytrmslatcdintolack

ofamplificatkxiprixiitcuratherthan(heappearancenfunxptxiGcpnxlucts)

克隆PCR產(chǎn)物問題與解答

1)克隨PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？

最佳插入片段：教體比需實(shí)驗(yàn)確定。1：1(插入片段：載體)常為最佳比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。

應(yīng)測定比值范圍。連接用5UI2X連接液，50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連凌酶，插入片段共10嘰

室溫保溫1小時，或40c過夜。在這2種溫度下，缺T?凸出端的載體會自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小

時能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需40c過夜。

2）PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？

如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。

少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此

需在克隆前做凝膠純化。

3）如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實(shí)驗(yàn)？

A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。

如有菌落，表明氨節(jié)失效，或污染上帶有氨節(jié)抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨不抗型的菌落。

B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率。

例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100W感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到10005后，用100W

鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個菌落。轉(zhuǎn)化率為：產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。

鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ngDNA,用SOC稀釋到1000u

后含10ngDNA,用1/10鋪板，共用1ngDNA。轉(zhuǎn)化率為：

1000克隆X10（3次方）ng/鋪板1ngDNAug=10（G次方）cfu/ug

轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細(xì)胞

如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。

C）如用pGEM-T正對照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生＞20?40藍(lán)斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細(xì)

胞），表明載體失去T?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4DNA連接酶（M1801,M1804,M1794）質(zhì)量標(biāo)

準(zhǔn)好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的T4DNA連接酶替換。

D）用pGEM-T或pGEM-TEasy載體，連接pGEM-T正對照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,

按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生＞2040藍(lán)斑，沒有菌落或少有菌落,

連接有問題。

4）對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問題？

A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需40c過夜。

B）插入片段帶有污染，使3,-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM?T正對照混合，

再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核

酸酶，使pGEM-T或pGEMTEasy載體35缺失。

C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發(fā)生。UV過度照射會產(chǎn)生嗑

咤二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。

D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無A,后者是pGEM-T或pGEM-TEasy載體克隆

所需。加TaqDNA聚合酶和核昔酸可在末端加A。詳情查pGEM-TpGEM-TEasy載體技術(shù)資料（TM042）。

E）高度重復(fù)序列可能會不穩(wěn)定，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，

需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞

PCR假陰性問題總結(jié)

PCR的假陽性問題深受重視，但我個人認(rèn)為PCR假陰性問題相對于臨床檢測更為嚴(yán)重。其實(shí)PCR假陽

性的問題是比較單純的，一般僅涉及污染和引物的非特異性問題。而污染可以通過嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理，合

理的環(huán)境設(shè)置，以及加入UNG酶抗污染基本可以解決，而引物的非特異性問題基本屬于廠家試劑質(zhì)量問

題。而PCR的假陰性卻不同，它涉及了與PCR實(shí)驗(yàn)的幾乎所有人員和技術(shù)環(huán)節(jié)，十分復(fù)雜。就臨床而言，

大三陽檢出率低、甚至于GC鏡下都很多時，PCR仍為陰性的事情也經(jīng)常發(fā)生，可見假陰性問題的嚴(yán)重性。

就PCR假陰性問題總體來說有如下因素:

一.儀器因素

PCR實(shí)驗(yàn)對儀器的依賴性是很高的，離心機(jī)、擴(kuò)增儀都是造成PCR假陰性的因素。擴(kuò)增儀的主要問

題是孔間差，引起擴(kuò)增失敗可擴(kuò)增效率降低。而離心機(jī)的影響則更容易被忽視。國內(nèi)使用離心機(jī)很少使用

離心加速度（XXXg）作為參數(shù)指標(biāo)，而常使用轉(zhuǎn)數(shù)作為參數(shù)指標(biāo)，這里就存在著一個問題，由于離心機(jī)

的大小不同，有效跳心半徑也不相同，因此同樣的轉(zhuǎn)速所產(chǎn)生的離心力相差很大（有的在數(shù)倍以上），所以

在相同的離心時間下，有可能模板并沒有離心下來，造成PCR假陰性。這個問題在其他實(shí)驗(yàn)也有，但因

基他實(shí)驗(yàn)都是測定大分子蛋白沉淀，對離心的速度要求較低所以不太明顯。建議使用小型臺式離心機(jī)的實(shí)

驗(yàn)要注意一下這個問題。

二.試劑質(zhì)量問題

PCR實(shí)驗(yàn)的成功與否試劑的質(zhì)量至關(guān)重要，試劑的質(zhì)量問題涉及多個方面：細(xì)胞的裂解：模板的抽提：

引物位點(diǎn)的選擇；Taq的的活性等等。其中任環(huán)節(jié)出了問題都會引起結(jié)果的假陰性。這些都是試劑質(zhì)量

的問題，因此選用高質(zhì)量的PCR試劑非常重要。

三.核酸模板問題

核酸模板質(zhì)量問題是制約PCR最重要的因素之一。核酸模板在擴(kuò)增區(qū)出現(xiàn)斷裂、蛋白粘附、空間位

阻等模板質(zhì)量問題都有可能引起擴(kuò)增失敗造成結(jié)果的假陰性或定量不準(zhǔn)確。由于無論什么提取方法都不可

能得到完全理想化的核酸模板，因此核酸模板質(zhì)量雖然與試劑的質(zhì)量有關(guān)，但它不可能由試劑質(zhì)量完全解

決。

核酸模板問題除了模板本身的問題外，還存在模板溶液中抑制Taq醒活性成分（如某些蛋白、禹子等）

作用，而導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低甚至擴(kuò)增失敗的問題。對此，有人提倡進(jìn)行模板純化，效果較為明顯。但另一

個問題又出現(xiàn)了，那就是怎樣保證純化的回收率問題?？傊?，核酸模板問題是不可避免的問題，只能努力

去減少。

四.操作人員素質(zhì)問題

PCR實(shí)驗(yàn)的環(huán)節(jié)很多，而且對每一環(huán)節(jié)的質(zhì)量要求都很高，例如少加、漏加試劑、離心不充分、循環(huán)

參數(shù)設(shè)計錯誤、對于RNA抽提降解、逆轉(zhuǎn)錄失敗等等都能造成結(jié)果的假陰性。因此要求PCR的實(shí)驗(yàn)操作

人員有很好的素質(zhì)，能夠嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，并能敏銳的發(fā)現(xiàn)問題和解決問題。

五,其他

PCR實(shí)驗(yàn)中從樣品的采集、運(yùn)輸、保存開始就可以引起結(jié)果的假陰性，而對于病原體檢測（如HBV）

在人體血液系統(tǒng)出現(xiàn)有周期性變化也是值得注意的因素。

克隆PCR產(chǎn)物問題與解答

1）克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？

最佳插入片段：載體比需實(shí)驗(yàn)確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。

應(yīng)測定比值范圍。連接用5W2X連接液，50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連委酶，插入片段共10嘰

室溫保溫1小時，或40c過夜。在這2種溫度下，缺T?凸出端的載體會自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小

時能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需40c過夜。

2）PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？

如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。

少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此

需在克隆前做凝膠純化。

3）如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實(shí)驗(yàn)？

A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。

如有菌落，表明氨羊失效，或污染上帶有氮節(jié)抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氮羊抗型的菌落。

B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率。

例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100W感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000W后，用100W

鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個菌落。轉(zhuǎn)化率為：產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。

鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ngDNA,用SOC稀釋到1000u

后含10ngDNA,用1/10鋪板，共用1ngDNA。轉(zhuǎn)化率為：

1000克隆X10（3次方）ng/鋪板1ngDNAug=10（6次方）cfu/ug

轉(zhuǎn)化pGEM?T應(yīng)用10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細(xì)胞

如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。

C）如用pGEM-T正對照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生＞20-40藍(lán)斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細(xì)

胞），表明載體失去T?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4DNA連接酶（M1801,M1804,M1794）質(zhì)量標(biāo)

準(zhǔn)好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的T4DNA連接酸替換。

D）用pGEM-T或pGEM-TEasy載體，連接pGEM-T正對照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,

按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生＞2?40藍(lán)斑，沒有菌落或少有菌落，

連接有問題。

4）對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問題？

A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需40c過夜。

B）插入片段帶有污染，使3,-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM?T正對照混合,

再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核

酸酶，使pGEM-T或pGEM-TEasy載體3,-T缺失。

C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發(fā)生。UV過度照射會產(chǎn)生嗑

咤二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。

D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無A,后者是pGEM-T或pGEM?TEasv教體克隆

所需。加TaqDNA聚合酶和核昔酸可在末端加A。詳情查pGEM-TpGEM-TEasy載體技術(shù)資料（TM042）。

E）高度重復(fù)序列可能會不穩(wěn)定，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，

需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞

PCR反應(yīng)中Taq酶的選擇

隨著分子生物學(xué)研究發(fā)展的不斷廠泛和深入，PCR已成為一門相當(dāng)成熟的常規(guī)技術(shù)，而熱

聚合酶（即Taq酶）的合理選擇是PCR成敗與否的一個關(guān)鍵因素。目前市面上有多種Taq

酶，能夠滿足多方面的實(shí)驗(yàn)需要。那么，如何選擇最合適的Taq酶？根據(jù)用戶經(jīng)?？紤]的指

標(biāo)，如特異性、保真性、耐熱性、擴(kuò)增速率、擴(kuò)增片段長度、能否進(jìn)行復(fù)雜模板擴(kuò)增以及優(yōu)

化條件難易等等，我們在這兒將主要的Taq酶歸歸類，其性質(zhì)、用途也就一目了然了。

高特異性Taq酶

高度特異性地擴(kuò)增所需的片段是PCR最基本的要求，影響PCR特異性的因素很多，包括

模板、引物性質(zhì)及質(zhì)量、反應(yīng)條件的控制等等，而高特異性T