流感病毒的分離技術(shù)操作規(guī)范

流感病毒的分離技術(shù)操作規(guī)范病毒分離培養(yǎng)是流感樣病例病原學(xué)監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)，是流感病毒檢測(cè)最常用和最可靠的方法之一。目前多采用雞胚和MDCK細(xì)胞進(jìn)行流感病毒分離。通過(guò)雞胚分離的流感毒株與原始標(biāo)本的抗原性和基因特性可能會(huì)有所不同，而通過(guò)MDCK細(xì)胞所分離的流感病毒與原始標(biāo)本相似。另外由于“O”相毒株的重現(xiàn)，MDCK細(xì)胞對(duì)“O”相毒株的敏感性遠(yuǎn)高于雞胚，所以MDCK細(xì)胞已成為流感病毒分離不可缺少的一種宿主系統(tǒng)。但是目前全球主要使用雞胚進(jìn)行流感疫苗生產(chǎn)，MDCK分離的病毒在很多國(guó)家尚未批準(zhǔn)用于疫苗生產(chǎn)，因此雞胚分離仍然發(fā)揮著舉足輕重的作用。具備流感病毒分離能力的流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室收到哨點(diǎn)醫(yī)院的常規(guī)監(jiān)測(cè)標(biāo)本后，要求利用狀態(tài)良好的MDCK細(xì)胞和（或）雞胚進(jìn)行病毒分離。若同時(shí)進(jìn)行MDCK細(xì)胞和雞胚分離，為減少工作量，可先用MDCK細(xì)胞對(duì)原始標(biāo)本進(jìn)行篩選，MDCK細(xì)胞病毒分離結(jié)果為陽(yáng)性后，再將另外一份-70℃或以下溫度保存的原始標(biāo)本進(jìn)行雞胚雙腔接種（羊膜腔和尿囊腔），進(jìn)行病毒分離。（一）實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別和生物安全規(guī)定1.流感病毒分離實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別：季節(jié)性流感病毒和2009甲型H1N1流感病毒生物安全二級(jí)；高致病性禽流感病毒生物安全三級(jí)。2.流感病毒分離實(shí)驗(yàn)室生物安全規(guī)定應(yīng)當(dāng)遵守生物安全實(shí)驗(yàn)室的有關(guān)生物安全的規(guī)定。（二）流感病毒的細(xì)胞分離標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（所列試劑生產(chǎn)廠家及貨號(hào)僅供參考）1.試驗(yàn)材料剛75-90％成片的MDCK細(xì)胞，T-25細(xì)胞瓶TPCK處理胰酶（牛胰腺來(lái)源Ⅷ型）（SIGMAT8802）HEPES緩沖液,1M母液D-MEM培養(yǎng)基（高糖，含有L-谷氨酰胺），Hank's液青、鏈霉素母液(10,000U/mL青霉素G，10,000μg/mL硫酸鏈霉素)牛血清白蛋白組分Ⅴ，7.5%溶液（GIBCOCatNo15260）處理好的臨床標(biāo)本0.5mL（標(biāo)本處理參見附件1第一部分）無(wú)菌移液管：1mL和10mL2.培養(yǎng)基和試劑的準(zhǔn)備（建議：經(jīng)常檢查試劑的有效期）500mLD-MEM液中加入：青、鏈霉素母液5mL(終濃度達(dá)：100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)牛血清白蛋白組分V12.5mL(終濃度:0.25％)HEPES緩沖液12.5mL(終濃度:25mM)加入7.5%NaHCO310-15mL（終濃度：2-3%)病毒生長(zhǎng)液：再向上述培養(yǎng)液中每500mL加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液濃度為2mg/mL）使TPCK-胰酶的濃度為2μg/mL。3.流感病毒MDCK細(xì)胞分離程序所有有關(guān)流感病毒分離的操作都應(yīng)在相應(yīng)生物安全級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，必須遵守生物安全規(guī)定，嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和廢棄物管理規(guī)定，做好個(gè)人防護(hù)要求。75～90％成片細(xì)胞的準(zhǔn)備用40倍光學(xué)顯微鏡鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK細(xì)胞用于病毒的分離。輕輕倒出細(xì)胞生長(zhǎng)液，用10mL的無(wú)菌移液管吸6mLpH7.4-7.6的Hank's液清洗細(xì)胞3遍。接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶用無(wú)菌的移液管將清洗細(xì)胞的Hank's液從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中移出。用無(wú)菌的移液管吸取500μl臨床樣品置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，溫和搖動(dòng)數(shù)次，使之均勻鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶底。將步驟2）中的培養(yǎng)瓶放入35℃，5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1～2h。從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用10mL的無(wú)菌移液管吸取6mLpH7.4-7.6的Hank's液清洗細(xì)胞，加入5mL含終濃度2μg/mLTPCK-胰酶的病毒生長(zhǎng)液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。放置于35℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞病變情況（細(xì)胞病變的特征是細(xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大成網(wǎng)狀，細(xì)胞核固縮或破裂，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞部分或全部脫落）。細(xì)胞培養(yǎng)物的收獲當(dāng)75％～100％細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)進(jìn)行收獲。即使無(wú)細(xì)胞病變也應(yīng)該于第7天收獲。進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(HA)，用HI方法進(jìn)行流感病毒的鑒定（具體方法參見附件1：五、紅細(xì)胞凝集及紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)）。對(duì)于HA≤8的細(xì)胞分離物,進(jìn)行10-1～0-3稀釋后，再感染細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞傳代，直至HA≥8時(shí)才能利用HI方法進(jìn)行病毒的鑒定。經(jīng)連續(xù)傳代2次以上，HA<8者，可以用核酸檢測(cè)方法鑒定分型。（三）流感病毒雞胚分離標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1.試驗(yàn)材料9～11日齡雞胚照卵燈70％～75％酒精一次性注射器雞蛋開孔器蠟、膠水或膠布10mL試管和試管架10mL移液管無(wú)菌鑷子2.流感病毒雞胚分離程序所有有關(guān)病毒分離的操作都應(yīng)遵守生物安全規(guī)定，嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和廢棄物管理規(guī)定。進(jìn)入生物安全實(shí)驗(yàn)室要求遵循生物安全實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)要求。（1）驗(yàn)卵用照卵燈檢測(cè)雞胚，標(biāo)記出雞胚的氣室與尿囊腔的界限、胚胎的位置。如果雞胚是死胚、沒(méi)有受精、有裂痕、發(fā)育不全或表面有好多滲水孔，應(yīng)棄掉。如何判斷雞胚狀態(tài)血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血帶或淤血塊。胎動(dòng)：活胚有明顯的自然運(yùn)動(dòng)，但是大于14天的胎動(dòng)則不明顯；死胚無(wú)胎動(dòng)。絨毛尿囊膜發(fā)育界限：血管密布的絨毛尿囊膜與雞胚胎的另一面（卵黃囊）形成明顯的界限。（2）雞胚接種(照視下雙腔接種法)將雞胚的氣室朝上放置在蛋盤上，標(biāo)記每個(gè)雞胚,通常每個(gè)樣本接種3個(gè)雞胚。用70％～75％酒精消毒雞胚表面，在氣室端鉆孔，開約6x6mm裂口。注射器裝上16號(hào)針頭，吸200μL處理過(guò)的臨床標(biāo)本。從裂口中滴入無(wú)菌的液體石蠟，然后輕輕晃動(dòng)雞胚，讓液體石蠟在雞胚殼膜內(nèi)層（臟層）鋪開大約1cm2面積（石蠟層不可將殼膜內(nèi)層完全覆蓋，會(huì)導(dǎo)致死胚），此時(shí)在照卵燈下即可清楚的看到雞胚胎的位置。將注射針頭緩慢刺入胚胎的鄂下胸前，用針頭輕輕撥動(dòng)下顎及腿，當(dāng)進(jìn)入羊膜腔時(shí)，能看到雞胚隨著針頭的撥動(dòng)而動(dòng)，即可注射100μl臨床標(biāo)本。將針頭退出至1/2寸長(zhǎng)度，將另外100μl臨床標(biāo)本注入雞胚尿囊腔。用同一注射器和針頭將同一標(biāo)本依上法接種另外兩枚雞胚。將針頭棄于合適的生物安全裝置中。用消毒過(guò)的醫(yī)用膠布封口。33～35℃溫箱培養(yǎng)雞胚2～3天。一般A型流感病毒培養(yǎng)2天，B型流感病毒培養(yǎng)3天，臨床采樣標(biāo)本通常培養(yǎng)3天。雞胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)時(shí)，每天檢查雞胚生長(zhǎng)情況，24h內(nèi)死亡的雞胚，認(rèn)為是非特異死亡應(yīng)棄去。（3）雞胚尿囊液和羊水的收獲雞胚在收獲前應(yīng)置4℃過(guò)夜或至少放置4h。標(biāo)記15mL無(wú)菌塑料管與相應(yīng)的雞胚編號(hào)一致。用70％～75％酒精消毒雞胚頂部。用無(wú)菌鑷子撕破雞胚氣室蛋殼，推開雞胚尿囊膜。用10mL吸管吸取雞胚尿囊液置于相應(yīng)的收集管中。用吸管或無(wú)菌鑷子刺破雞胚羊膜，吸取羊水放置于另外的管中。羊水較少時(shí)也可以將3個(gè)雞胚的羊水合并。將雞胚收獲液3000rpm離心5min去除血液和細(xì)胞。進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。沒(méi)有紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象的標(biāo)本，應(yīng)再進(jìn)行雞胚盲傳2次（對(duì)于“O”相的毒株，需要連續(xù)傳代多次才能具備在雞胚中生長(zhǎng)的特性），盲傳后HA滴度仍為陰性的標(biāo)本，可按有關(guān)生物安全規(guī)定進(jìn)行處理。對(duì)于HA<8的雞胚分離物進(jìn)行10-1～10-3稀釋后，繼續(xù)進(jìn)行雞胚傳代，HA≥8時(shí)才能利用HI方法進(jìn)行病毒的鑒定。經(jīng)連續(xù)傳代2次后HA<8者，可以用核酸檢測(cè)方法鑒定分型