第六章 酶分子工程概述課件

第六章酶分子工程概述第六章酶的分子工程之一：概述第六章酶分子工程概述第一節(jié)酶的分子工程原因：1．穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)

的需要。2．作用的最適條件不符。3．酶的主要?jiǎng)恿W(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)。4．臨床應(yīng)用的特殊要求。5.。。。第六章酶分子工程概述酶的分子工程

——molecularengineeringoftheenzyme

主要指化學(xué)或分子生物學(xué)方法對(duì)酶分子進(jìn)行改造

第六章酶分子工程概述洗衣粉:枯草芽孢桿菌蛋白酶加強(qiáng)去污能力，在漂白劑的作用下易失去活性。Met-222被氧化將酶蛋白分子中的氨基酸(Met-222)進(jìn)行替代，使酶的抗氧化能力大大提高，因而可與漂白劑同時(shí)使用。第六章酶分子工程概述第六章酶分子工程概述分兩部分：對(duì)天然酶分子進(jìn)行改造，包括酶一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸置換、肽鏈切割、氨基酸側(cè)鏈修飾等分子生物學(xué)水平，即用基因工程方法對(duì)DNA或RNA進(jìn)行分子改造，以獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)更為合理的酶蛋白第六章酶分子工程概述1、化學(xué)酶工程又稱為初級(jí)酶工程(Primaryenzymeengineering)，它主要由酶學(xué)與化學(xué)工程技術(shù)相互結(jié)合而形成，通過(guò)化學(xué)修飾、固定化處理、甚至通過(guò)化學(xué)合成法等手段，改善酶的性質(zhì)以提高催化效率及降低成本。第六章酶分子工程概述它包括：自然酶化學(xué)修飾酶固定化酶化學(xué)人工酶等等的研究和應(yīng)用。第六章酶分子工程概述2.生物酶工程：是酶學(xué)和以DNA重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合一門新興的生物工程，亦稱高級(jí)酶工程(AdvancedEnzymeEngineering)。第六章酶分子工程概述生物酶工程：克隆酶突變酶新酶第六章酶分子工程概述基因工程基本過(guò)程克隆酶第六章酶分子工程概述第六章酶分子工程概述20世紀(jì)90年代，隨著基因工程的廣泛介入，一些原來(lái)只能由動(dòng)物或植物生產(chǎn)的酶，經(jīng)過(guò)酶基因重組，可以在微生物上表達(dá)——擺脫對(duì)天然酶的依賴?！盎蚬こ蹋l(fā)酵工藝＋先進(jìn)的發(fā)酵設(shè)備”

——酶工業(yè)的重大飛躍第六章酶分子工程概述最成功的例子：人纖維蛋白溶酶原激活劑促進(jìn)溶解血塊中的纖維蛋白。臨床上用于治療血栓性疾病，促進(jìn)體內(nèi)血栓的溶解。利用工程菌株生產(chǎn)的纖維蛋白溶酶原激活劑在療效上與人體合成的酶完全一效，目前已用于臨床試驗(yàn)。

凝乳蛋白酶生產(chǎn)乳酪的必需用酶，其來(lái)源有限。人們克隆了小牛凝乳酶基因在酵母系統(tǒng)中表達(dá)，得到的凝乳酶與從小牛胃中提取的天然酶性質(zhì)完全一致。第六章酶分子工程概述突變酶第六章酶分子工程概述定向進(jìn)化示意圖隨機(jī)突變+定向選擇＝目標(biāo)突變體細(xì)菌誘發(fā)突變的因素50

0C培養(yǎng)突變體庫(kù)選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長(zhǎng)溫度為370C最適生長(zhǎng)溫度提高了！第六章酶分子工程概述超自然的優(yōu)質(zhì)酶新酶Thisimageshowsacomputer-generatedmodelforthedesignofanewenzymenotfoundinnature.Thisparticularproteindesign,calledretro-aldolase22,wastestedandwasabletoenhancetherateofacarbonbondbreakingchemicalreaction10,000timesovertherateoftheuncatalyzedreaction.

Beingabletobreakcarbonbondsmorequicklyandefficientlycouldleadtoimprovementsincleaninguporganicwasteandindevelopingrenewableenergysources

ImagesbyLinJiangandEricAlthoff,UniversityofWashingtonandHowardHughesMedicalInstitute.thedesignedactivesite(greymeshing)第六章酶分子工程概述第二節(jié)

酶蛋白的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化第六章酶分子工程概述酶的穩(wěn)定性

（enzymestability）是指酶分子抵抗各種不利因素影響，維持一定空間結(jié)構(gòu)，保持生物活性相對(duì)穩(wěn)定的能力。在細(xì)胞內(nèi)，酶分子受到內(nèi)膜系統(tǒng)保護(hù)，而且處于還原性環(huán)境，不易被氧化失活。而酶工程所涉及的催化過(guò)程幾乎都在體外，條件比細(xì)胞內(nèi)環(huán)境惡劣得多，酶不穩(wěn)定的缺點(diǎn)顯得尤其突出。第六章酶分子工程概述穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)是酶催化活性穩(wěn)定的基礎(chǔ)從分子水平上看一級(jí)結(jié)構(gòu)：肽鍵和二硫鍵。酶分子空間結(jié)構(gòu)通常比一級(jí)結(jié)構(gòu)更為脆弱，非共價(jià)鍵包括疏水鍵、氫鍵、離子鍵、范德華力、金屬離子結(jié)合等。一、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的分子原因第六章酶分子工程概述蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的分子原因：A:金屬離子、底物、輔助因子和其他相對(duì)分子質(zhì)量配體的結(jié)合作用第六章酶分子工程概述金屬離子由于結(jié)合到多肽鏈的不穩(wěn)定部分（特別是彎曲處），因而可以顯著增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。當(dāng)酶與底物、輔因子和其它低分子量配體相互作用時(shí)，也會(huì)看到蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的增加。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與上述效應(yīng)子的作用常使蛋白質(zhì)發(fā)生構(gòu)象變化，使其構(gòu)象更穩(wěn)定。第六章酶分子工程概述B:蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-脂的作用當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)形成復(fù)合物時(shí)，脂分子或蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定到疏水簇上，因而防止疏水簇與溶劑的接觸，屏蔽了蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域第六章酶分子工程概述在體內(nèi)，蛋白質(zhì)常與脂類或多糖相互作用，形成復(fù)合物，從而顯著增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子表面上既有疏水簇，也有極性和帶電基團(tuán)。從熱力學(xué)上看，疏水簇與水的接觸對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是不利的。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)形成復(fù)合物時(shí)，脂分子或蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定到疏水簇上，因而防止疏水簇與溶劑的接觸，屏蔽了蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域第六章酶分子工程概述C:鹽鍵和氫鍵數(shù)目較少，但對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性貢獻(xiàn)很顯著目前認(rèn)為：氫鍵與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性關(guān)系不大3-磷酸-甘油醛脫氫酶：

來(lái)源：嗜熱脂肪芽孢桿菌兔肌

結(jié)構(gòu)很類似，但嗜熱的酶亞基間區(qū)域有鹽橋協(xié)作系統(tǒng)，而嗜溫的酶沒(méi)有。

因此嗜熱酶的催化活力的變性溫度和最適溫度都比嗜溫酶高出約20℃。第六章酶分子工程概述D：二硫鍵Disulfidebond大分子的分子內(nèi)交聯(lián)可增強(qiáng)其堅(jiān)實(shí)性，并提高其在溶液中的穩(wěn)定性

在酶分子中引入-SH，或者，用雙功能試劑實(shí)現(xiàn)分子內(nèi)交聯(lián)，也能使蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定化第六章酶分子工程概述引入二硫鍵研究發(fā)現(xiàn)，在酶蛋白中引入半胱氨酸，從而增加酶蛋白中二硫鍵的數(shù)量可以增加某些酶的穩(wěn)定性，但不影響酶的活性。Tumnen等報(bào)道將Trichodermareesei的木聚糖酶II的一個(gè)α-螺旋中的Ser-110和Asp-154分別突變?yōu)镃ys，從而在110位和154位建立一個(gè)二硫鍵，65℃時(shí)的半衰期從不到1min增加到14min。Wakarchuk等在木聚糖酶分子中引入不影響其活性的二硫鍵，使其耐熱性提高了15℃。第六章酶分子工程概述用二硫鍵穩(wěn)定蛋白質(zhì)的思想來(lái)自于聚合物化學(xué)。五十年代中期已經(jīng)證明，大分子的分子內(nèi)交聯(lián)可增強(qiáng)其堅(jiān)實(shí)性，并提高其在溶液中的穩(wěn)定性。穩(wěn)定化指的是熵性質(zhì)：由于交聯(lián)即蛋白質(zhì)中形成二硫鍵，伸展蛋白質(zhì)的熵急劇降低，因而天然蛋白和變性蛋白的自由能間的差別增加。這個(gè)穩(wěn)定化效應(yīng)值隨著肽鏈中氨基酸數(shù)目的增加而增加。類似的，用雙功能試劑實(shí)現(xiàn)分子內(nèi)交聯(lián)，也能使蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定化，這點(diǎn)我們?cè)诤竺孢€會(huì)提到。第六章酶分子工程概述E：疏水相互作用對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性非常重要增加疏水作用數(shù)目是穩(wěn)定蛋白質(zhì)的實(shí)用方法。降低蛋白質(zhì)表面的疏水性質(zhì)；增加蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性。從實(shí)驗(yàn)上看，可用定點(diǎn)突變或化學(xué)修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的。第六章酶分子工程概述F：對(duì)氧化修飾敏感的氨基酸含量較低結(jié)構(gòu)上重要的氨基酸殘基（如活性部位氨基酸）的氧化作用是蛋白質(zhì)失活的最常見(jiàn)的機(jī)理之一。半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚環(huán)，對(duì)氧化特別敏感因此，這些不穩(wěn)定氨基酸的數(shù)目，在高度穩(wěn)定的嗜熱蛋白質(zhì)中比在相應(yīng)的嗜溫蛋白質(zhì)中顯著偏低第六章酶分子工程概述MAPK磷酸酶（MPKs）削弱應(yīng)激激活的MAPK信號(hào)傳遞。MPK含有一個(gè)半胱氨酸巰基（sulfhydrylgroup），決定其催化活性。如果該基團(tuán)在活性氧簇（reactiveoxygenspecies，ROS）下發(fā)生氧化，MPK活性不可逆地消失第六章酶分子工程概述G：氨基酸殘基的堅(jiān)實(shí)裝配蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中仍有空隙,通常為水分子所充滿。分子量為2―3萬(wàn)的蛋白質(zhì)中約有個(gè)5―15水分子，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。因此，蛋白質(zhì)的堅(jiān)實(shí)化可作為一種人為穩(wěn)定蛋白質(zhì)的方法第六章酶分子工程概述溶液中的蛋白質(zhì)似乎裝配緊密，其緊密程度類似于低分子量化合物的晶體狀態(tài)。盡管如此，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中仍有空隙。按照Chothia說(shuō)法，蛋白球體積的大約25%仍未充滿，即不是被氨基酸占據(jù)。但溶質(zhì)分子可以包埋在這些孔隙中。這些孔隙通常為水分子所充滿。由布朗運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)的極性水分子與球體疏水核的接觸當(dāng)然會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。隨著水分子從孔隙中除去，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更堅(jiān)實(shí)，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性也增加。因此，蛋白質(zhì)的堅(jiān)實(shí)化可作為一種人為穩(wěn)定蛋白質(zhì)的方法。第六章酶分子工程概述蛋白質(zhì)穩(wěn)定性因素金屬離子、底物、輔因子和其它低分子質(zhì)量配體的結(jié)合使蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定；蛋白質(zhì)與其它的生物大分子尤其是蛋白質(zhì)與脂的作用；鹽鍵

；疏水相互作用；氫鍵；二硫鍵；對(duì)氧化修飾敏感的氨基酸含量降低；氨基酸殘基的堅(jiān)實(shí)裝配。第六章酶分子工程概述二、蛋白質(zhì)不可逆失活的原理和機(jī)理第六章酶分子工程概述酶在使用和貯存過(guò)程中的失活常是由于微生物和外源蛋白水解酶作用的結(jié)果。蛋白水解酶可催化肽鍵水解。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)底物也是一種蛋白水解酶時(shí)，就會(huì)發(fā)生自我降解現(xiàn)象，叫作自溶

1.蛋白水解酶和自溶作用

第六章酶分子工程概述2.聚合作用聚合很久以來(lái)就被認(rèn)為是蛋白質(zhì)失活的一種機(jī)理。首先，單分子（N）構(gòu)象變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)可逆變性(U)。使包埋的疏水性氨基酸殘基暴露于水溶劑。其次，這種三級(jí)結(jié)構(gòu)改變了的蛋白質(zhì)分子彼此締合（A），以最大限度地減少疏水氨基酸殘基的不利的裸露。最后，如果蛋白質(zhì)當(dāng)中含cys，形成二硫鍵（As）當(dāng)然，聚合作用不一定是不可逆的：用變性劑破壞非共價(jià)力（氫鍵或疏水鍵）還原或氧化再生二硫鍵，可使蛋白質(zhì)活化。NUAAs第六章酶分子工程概述聚合很久以來(lái)就被認(rèn)為是蛋白質(zhì)失活的一種機(jī)理。大約100年前，科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)，加熱蛋白水溶液會(huì)形成沉淀。聚合分三步進(jìn)行：N≒U→A→As其中N≒U代表可逆伸展，A是聚合的蛋白質(zhì)，As是發(fā)生了二硫交換反應(yīng)的蛋白質(zhì)聚合物。首先，必須發(fā)生單分子構(gòu)象變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)可逆變性。這個(gè)過(guò)程使包埋的疏水性氨基酸殘基暴露于水溶劑。其次，這種三級(jí)結(jié)構(gòu)改變了的蛋白質(zhì)分子彼此締合，以最大限度地減少疏水氨基酸殘基的不利的裸露。最后，如果蛋白質(zhì)分子含有半胱氨酸和胱氨酸殘基，則會(huì)發(fā)生分子間二硫交換反應(yīng)。與許多其它蛋白質(zhì)失活原因不同，聚合并不一定是不可逆的。使用變性劑破壞分子間的非共價(jià)力（氫鍵或疏水相互作用），在去除變性劑時(shí)，通過(guò)還原和再氧化再生天然二硫鍵，則有可能使蛋白質(zhì)再活化。第六章酶分子工程概述注意：聚合和簡(jiǎn)單的沉淀作用是有區(qū)別的。簡(jiǎn)單的沉淀：蛋白質(zhì)并未發(fā)生顯著的構(gòu)象變化即從溶液中析出。因此，沉淀很易再溶于水溶液中，并恢復(fù)其全部天然特性，就象結(jié)晶蛋白和凍干蛋白質(zhì)那樣。第六章酶分子工程概述3.極端pH極端pH能啟動(dòng)改變、交聯(lián)或破壞氨基酸殘基的化學(xué)反應(yīng)，結(jié)果引起不可逆失活。遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子內(nèi)相同電荷間的靜電斥力會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)伸展。但這些構(gòu)象變化常能導(dǎo)致不可逆聚合；對(duì)蛋白酶來(lái)說(shuō)，常導(dǎo)致自溶第六章酶分子工程概述肽鍵水解也容易在強(qiáng)酸條件下或中等pH和高溫相結(jié)合的條件下發(fā)生。6mol/LHCl，24h,110℃：蛋白質(zhì)可完全水解成氨基酸。在Asp所處的肽鍵在不太酸的環(huán)境下短時(shí)間也易水解（尤其是Asp-Pro）。Asn和Gln的脫胺作用，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的疏水性內(nèi)部引進(jìn)入負(fù)電荷，使得酶失活第六章酶分子工程概述食品加工時(shí)，蛋白質(zhì)一般要暴露于堿性條件，發(fā)生各種各樣的反應(yīng)，其中包括肽鍵水解、脫胺、精氨酸水解成鳥(niǎo)氨酸、β-消除和外消旋化、雙鍵形成、氨基酸殘基破壞和形成新的氨基酸。第六章酶分子工程概述4.氧化作用各種氧化劑能氧化帶芳香族側(cè)鏈的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸殘基。分子氧，H2O2和氧自由基是常見(jiàn)的蛋白質(zhì)氧化劑。第六章酶分子工程概述H2O2是非專一性氧化劑。在酸性條件下，它主要把蛋氨酸氧化成它的亞砜。雖然蛋氨酸亞砜在體內(nèi)可被酶、在體外可被巰基化合物還原，但這個(gè)反應(yīng)限制了酶在工業(yè)上的應(yīng)用和貯存。在生物系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)的氧化失活是通過(guò)活性氧（·OH、O2ˉ、H2O2、OCI-）來(lái)完成的。例如，中性白細(xì)胞可以產(chǎn)生高濃度的氧化劑殺死細(xì)菌。第六章酶分子工程概述5.表面活性劑和去污劑去污劑有離子性和非離子性兩大類，都含有長(zhǎng)鏈?zhǔn)杷舶?，但“頭”部基團(tuán)不同，有帶電的，有不帶電的。去污劑的親水部分和疏水部分之間的相對(duì)平衡是決定其行為的重要因素第六章酶分子工程概述對(duì)于幾乎所有的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，每克蛋白質(zhì)結(jié)合SDS的最大量類似，大約1.4g/g。SDS-多肽復(fù)合物本質(zhì)上是膠團(tuán)，SDS分子聚集在蛋白質(zhì)暴露的疏水區(qū)域周圍。第六章酶分子工程概述6.變性劑脲和鹽酸胍高濃度鹽螯合有機(jī)溶劑第六章酶分子工程概述脲和鹽酸胍高濃度脲（8-10mol/L）和鹽酸胍（GdmC,6mol/L）常用于蛋白質(zhì)變性，作用機(jī)理不明確，可能：消除了在維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中起重要作用的疏水相互作用。直接與蛋白質(zhì)分子作用。第六章酶分子工程概述應(yīng)當(dāng)特別注意的是，由脲可自發(fā)形成氰酸鹽。8mol/L脲溶液平衡時(shí)大約含有0.02mol/L氰酸鹽。氰酸鹽可與蛋白質(zhì)中的氨基和巰基相互作用，引起不可逆失活。因此，脲溶液應(yīng)在用前用優(yōu)質(zhì)固體脲新鮮配制。第六章酶分子工程概述高濃度鹽

高濃度鹽對(duì)蛋白質(zhì)既可有穩(wěn)定作用，也可有變性作用，這要看鹽的性質(zhì)和濃度，(CH3)4N+>NH4+>K+,Na+>Mg2+>Ca2+>Ba2+>SO42->CI->Br->NO3->CIO4->SCN-越靠近序列左側(cè)的離子對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用越強(qiáng)，愈靠近該序列右邊的離子越使蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。例如，(NH4)2SO4是酶穩(wěn)定劑，貯存酶時(shí)常用它。

NaSCN（硫氰酸鈉）是酶的紊亂劑第六章酶分子工程概述越靠近序列左側(cè)的離子對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用越強(qiáng)，因?yàn)樗鼈兡芡ㄟ^(guò)增加溶液的離子強(qiáng)度，降低蛋白質(zhì)分子上疏水基團(tuán)的溶解度。此外，這些鹽能增加蛋白質(zhì)周圍的水簇，引起系統(tǒng)總自由能損失（水的熵降低）。這兩種效應(yīng)結(jié)合起來(lái)，通過(guò)鹽析疏水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)分子更堅(jiān)實(shí)，結(jié)果使蛋白質(zhì)穩(wěn)定。愈靠近該序列右邊的離子越使蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。這些離子能結(jié)合于蛋白質(zhì)的帶電基團(tuán)或結(jié)合于肽鍵的偶極子，結(jié)果降低蛋白質(zhì)周圍的水簇?cái)?shù)目。這種作用引起蛋白質(zhì)鹽溶，降低蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性。第六章酶分子工程概述螯合結(jié)合金屬離子的試劑,如EDTA能使金屬酶失活這類失活常常是不可逆的，相反，螯合劑通常可以穩(wěn)定不需要金屬離子的蛋白質(zhì)第六章酶分子工程概述

酶既可在水溶液中發(fā)揮作用，也可在無(wú)水有機(jī)溶劑中發(fā)揮作用。但當(dāng)與水混溶的有機(jī)溶劑加入蛋白質(zhì)水溶液中時(shí)，則可看到酶失活。這是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑通過(guò)疏水相互作用直接結(jié)合于蛋白質(zhì)，并改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù)。后者影響維持蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的非共價(jià)力的平衡。因此，有機(jī)溶劑通過(guò)增加疏水核的溶解度，降低帶電表面的溶解度而具有使蛋白質(zhì)“從里往外翻”的傾向。另一方面，蛋白質(zhì)（酶）要在幾乎無(wú)水的環(huán)境中發(fā)揮作用，必須在其分子表面有一單層必需水來(lái)維持它的活性構(gòu)象，而與水混溶的有機(jī)溶劑能奪去酶分子表面的必需水，因而使酶失活。第六章酶分子工程概述7.重金屬離子和巰基試劑已知重金屬陽(yáng)離子，如Hg2+，Cd2+，Pb2+能與蛋白質(zhì)的巰基反應(yīng)（將其轉(zhuǎn)化為硫醇鹽），也能與組氨酸和色氨酸殘基反應(yīng)。此外，銀或汞能催化水解二硫鍵巰基試劑通過(guò)還原二硫鍵也能使酶失活，但這個(gè)作用常是可逆的。第六章酶分子工程概述8.熱熱失活是最經(jīng)常遇到的蛋白質(zhì)失活工業(yè)上的酶法加工大多要求在較高溫度下進(jìn)行，因?yàn)檫@可以增加溶解度和反應(yīng)速度以及降低溶液粘度、防止微生物污染。所以熱失活是工業(yè)上最經(jīng)常遇到的酶失活的原因。第六章酶分子工程概述熱失活通常也是兩步過(guò)程：酶可逆熱伸展使它的反應(yīng)基團(tuán)和疏水區(qū)域暴露，隨后相互作用導(dǎo)致不可逆失活。有兩種構(gòu)象過(guò)程能引起不可逆熱失活。第一，由于熱伸展，包埋的疏水區(qū)域一旦暴露于溶劑，則會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)聚合。第二，單分子構(gòu)象擾動(dòng)能引起酶失活。高溫下，酶喪失其常規(guī)的非共價(jià)相互作用，但當(dāng)恢復(fù)常規(guī)條件時(shí)，在被擾動(dòng)的酶分子結(jié)構(gòu)中形成非天然的非共價(jià)相互作用，雖然這種結(jié)構(gòu)從熱力學(xué)上說(shuō)不如天然構(gòu)象穩(wěn)定，但由于純動(dòng)力學(xué)原因還能保存下來(lái)，因?yàn)槎嚯逆湹姆肿舆\(yùn)動(dòng)隨溫度降低而下降。高溫引起蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變：高溫（90-100℃）下，依賴pH的共價(jià)反應(yīng)限制了酶的熱穩(wěn)定性。這些反應(yīng)包括：Asn和Gln的脫胺作用，在Asp處的肽鍵水解，Cys的氧化，二硫交換作用和二硫鍵的破壞。上述這些破壞性反應(yīng)直接導(dǎo)致高溫下酶失活。此外，若系統(tǒng)中有還原糖（如葡萄糖），糖很易與Lys的ε-氨基作用，這叫“Maillard反應(yīng)”，是食品工業(yè)中熱失活的原因。第六章酶分子工程概述9.機(jī)械力壓力、剪切力、振動(dòng)超聲第六章酶分子工程概述1).振動(dòng)振動(dòng)使蛋白質(zhì)失活的機(jī)理是，振動(dòng)增加氣-液界面的面積。蛋白分子在這個(gè)界面上呈線性排列并伸展，以使疏水殘基最大限度地暴露于空氣。然后，蛋白質(zhì)由于疏水區(qū)域的暴露而聚合。第六章酶分子工程概述2).剪切

當(dāng)酶溶液快速通過(guò)管道或膜時(shí)，則在管（膜）壁處或靠近管（膜）壁處產(chǎn)生剪切力梯度。這個(gè)梯度能引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，導(dǎo)致原先埋藏的疏水區(qū)域暴露，然后聚合。失活程度隨剪切速度的增大和暴露時(shí)間的增長(zhǎng)而增加。第六章酶分子工程概述3).超聲波

超聲波壓力使溶解的氣體產(chǎn)生小氣泡，小氣泡迅速膨脹至一定程度時(shí)突然破碎，這就是空化作用，它既產(chǎn)生機(jī)械力，又產(chǎn)生化學(xué)變性劑（如在小氣泡中熱反應(yīng)所產(chǎn)生的自由基），結(jié)果使蛋白質(zhì)失活。第六章酶分子工程概述4).壓力0.1-6×108pa的壓力下可使酶失活。壓力誘導(dǎo)的失活通常認(rèn)為是蛋白質(zhì)變性后聚合的結(jié)果，但還有另外兩個(gè)失活機(jī)理：第一，已經(jīng)證明，多亞基酶在高壓下可解離成單體，取消壓力后，活力得到不同程度的恢復(fù)，但很多這類失活是不可逆的。第二，關(guān)于乳酸脫氫酶的工作表明，半胱氨酸氧化與失活機(jī)理有關(guān)，而這個(gè)反應(yīng)與壓力引起的酶結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。第六章酶分子工程概述10.冷凍和脫水低溫減弱疏水作用，引起蛋白質(zhì)的解離和變性溶質(zhì)（酶和鹽）隨著水分子的結(jié)晶而被濃縮，引起酶微環(huán)境中的pH和離子強(qiáng)度的劇烈改變。磷酸鹽緩沖液的pH在冷凍后可由7變到3.5，離子強(qiáng)度提高，引起寡聚蛋白質(zhì)的解離。第六章酶分子工程概述二硫交換或巰基氧化。酶濃度增加引起Cys濃度也增加。分子內(nèi)和分子間的二硫交換反應(yīng)就很容易發(fā)生，巰基在低溫下更易氧化，因?yàn)樵?3℃部分凍結(jié)系統(tǒng)內(nèi)的氧濃度要比0℃溶液中的高1150倍。這種濃縮效應(yīng)還能增加氧自由基的濃度。第六章酶分子工程概述11.輻射作用電離輻射：如γ射線，X射線，電子，α粒子等直接作用由于形成自由基而引起一級(jí)結(jié)構(gòu)的共價(jià)改變，繼而交聯(lián)或氨基酸破壞。這導(dǎo)致天然構(gòu)象喪失或聚合。間接作用是由于在水溶液中形成反應(yīng)性產(chǎn)物，其中主要是·OH自由基，溶解的電子和H2O2等。第六章酶分子工程概述蛋白質(zhì)失活既可由直接作用（輻射對(duì)蛋白質(zhì)分子的影響）引起，也可由間接作用（水輻射分解副產(chǎn)物對(duì)蛋白質(zhì)分子的影響）引起。第六章酶分子工程概述非電離輻射，如可見(jiàn)光，紫外線等可見(jiàn)光的光化學(xué)氧化要求光敏化染料，它能吸收光能，然后氧化蛋白分子中的敏感基團(tuán)（半胱氨基，色氨酸，組氨酸）。UV輻射能直接破壞蛋白質(zhì)的氨基酸而使蛋白質(zhì)失活；胱氨酸和色氨酸殘基特別不穩(wěn)定。第六章酶分子工程概述失活機(jī)理變性條件聚合（有時(shí)伴隨形成分子間二硫鍵）加熱，變性劑脲，鹽酸胍,SDS,振動(dòng)一級(jí)結(jié)構(gòu)改變1、酸、堿催化的肽鍵水解，蛋白水解和自溶作用極端pH值，加熱，蛋白水解酶2、功能基氧化（半胱氨酸巰基和色氨酸吲哚環(huán)）氧氣、氧氣代謝產(chǎn)物，輻射3、二硫鍵還原，分子間二硫交換加熱，高pH，巰基化合物,二硫化物4、必需巰基的化學(xué)修飾金屬離子，二硫化物5、蛋白質(zhì)磷酸化蛋白激酶6、在催化過(guò)程中由于反應(yīng)中間物（主要是自由基）引起的“自殺”失活底物7、氨基酸的外消旋化加熱，極端pH8、二硫鍵剪切后形成新氨基酸加熱，高pH9、天冬酰胺脫胺加熱，高PH輔酶分子從活性部位上解離螯合劑、透析、加熱，金屬離子寡聚蛋白解離成亞基化學(xué)修飾，極端pH,脲，表面活性劑，高溫或低溫吸附到容器表面蛋白質(zhì)濃度低,加熱“不可逆”構(gòu)象改變加熱，極端pH,有機(jī)溶劑,鹽酸胍流體中的剪切失活流體形變第六章酶分子工程概述三、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化酶分子的可逆伸展（不可逆失活的初始階段）黑體部分是酶的活性中心第六章酶分子工程概述當(dāng)酶暴露于一定濃度的變性劑或不利的環(huán)境條件時(shí)，這些非共價(jià)力先減弱，后破壞，引起酶分子至少部分伸展。伸展的結(jié)果損壞了酶的活性部位，引起酶失活這個(gè)伸展過(guò)程是完全可逆的。一旦除掉不利的條件，酶分子能重新折疊成它的催化活性形式，因?yàn)檫@種構(gòu)象從熱力學(xué)上說(shuō)是有利的。事實(shí)上，天然態(tài)和伸展態(tài)的自由能的凈差值是5-20Kcal/mol，此值只相當(dāng)于幾個(gè)額外的氫鍵或離子鍵的貢獻(xiàn)。第六章酶分子工程概述酶的不可逆失活示意圖第六章酶分子工程概述解決問(wèn)題要從兩方面著手：一是如何防止酶的可逆伸展，二是一旦酶發(fā)生可逆伸展，那么如何防止其不可逆失活反應(yīng)發(fā)生。第六章酶分子工程概述對(duì)于防止酶可逆伸展，可以開(kāi)發(fā)出普遍適用的方法，但對(duì)酶不可逆失活，由于原因復(fù)雜，還得需要一些特殊的穩(wěn)定化方法第六章酶分子工程概述穩(wěn)定天然酶的方法方法說(shuō)明固定化1、酶多點(diǎn)連接于載體上酶構(gòu)象堅(jiān)固化；立體障礙防止蛋白水解酶的降解作用2、分配效應(yīng)和擴(kuò)散限制載體的化學(xué)和物理性質(zhì)影響酶分子周圍的微環(huán)境非共價(jià)修飾1、添加劑專一性添加劑使N≒U平衡向N移動(dòng)；競(jìng)爭(zhēng)性添加劑除掉破壞性催化劑；有的中性鹽和多羥基化合物的保護(hù)作用2、反相膠團(tuán)反相膠團(tuán)中酶抵抗有機(jī)溶劑變性3、蛋白質(zhì)間相互作用酶的抗體保護(hù)酶化學(xué)修飾1、共價(jià)交聯(lián)使酶構(gòu)象堅(jiān)固化2、改變離子狀態(tài)或引入立體障礙的試劑修飾增加、中和或改變酶分子上的帶電殘基；可溶性大分子的連結(jié)抑制與其它溶質(zhì)（蛋白酶）的相互作用蛋白質(zhì)工程定點(diǎn)突變?nèi)〈环€(wěn)定的氨基酸殘基，引入穩(wěn)定酶的因素第六章酶分子工程概述1.固定化：（A）交聯(lián)（B）共價(jià)連接或吸附（C）包埋可以使酶構(gòu)象更加堅(jiān)牢，從而阻止酶構(gòu)象從折疊態(tài)向伸展態(tài)過(guò)渡,并可抑制酶的自降解

第六章酶分子工程概述2、非共價(jià)修飾1)．反相膠團(tuán)（束）第六章酶分子工程概述

所謂反膠團(tuán),是指當(dāng)油相中表面活性劑的濃度超過(guò)臨界膠束濃度后,其分子在非極性溶劑中自發(fā)形成的親水基向內(nèi)、疏水基向外的具有極性內(nèi)核的多分子聚集體第六章酶分子工程概述隨著表面活性劑在水中濃度的增大,水相表面張力降低得很快,當(dāng)表面活性劑量達(dá)到某個(gè)定值(稱為臨界膠束濃度)后,溶液中形成了由50個(gè)~100個(gè)乳化劑分子組成的聚集體,稱為膠束用適當(dāng)?shù)目诖衩富蚴姑肝⒛一?，可使酶在不利環(huán)境下有效地起作用。反相膠團(tuán)最易提供這種微囊化。反相膠團(tuán)是由兩性化合物在占優(yōu)勢(shì)的有機(jī)相中形成的第六章酶分子工程概述蔗糖酶

包埋在由SDS和苯等組成的反相膠團(tuán)中的的活力比其在水介質(zhì)中的活力高4倍多，而且維持活力的時(shí)間由48h延長(zhǎng)至7天。視溶劑和表面活性劑的組成，可在與水不混溶的溶劑中得到微乳化的反相膠團(tuán)。反相膠團(tuán)不僅可以保護(hù)酶，還能提高酶活力，改變酶的專一性。第六章酶分子工程概述事實(shí)上，在保證酶有效作用所必需的水量的前提下，酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性比在水中更好。例如，在干燥的三丁酸甘油酯中的脂肪酶相當(dāng)穩(wěn)定，100℃時(shí)的半壽期大于12h,而水含量大于1%時(shí)，酶立即失活。這主要是由于酶在無(wú)水有機(jī)溶劑中的構(gòu)象高度堅(jiān)實(shí)化，有機(jī)溶劑“凍結(jié)”了酶的活化構(gòu)象。另外一個(gè)原因是缺乏游離水，而實(shí)驗(yàn)證明，酶的任何一個(gè)失活過(guò)程都需要水的參與。第六章酶分子工程概述2)．添加劑：可增加溶液酶或凍干過(guò)程中酶的穩(wěn)定性

添加劑不僅可以提高酶的熱穩(wěn)定性，還可提高酶抗蛋白水解、抗化學(xué)試劑、抗pH變化、抗變性劑、抗稀釋作用等的穩(wěn)定性。專一性的底物和配體；非專一性的中性鹽和多羥基化合物（如甘油、糖和聚乙二醇）；與酶失活劑競(jìng)爭(zhēng)的物質(zhì)或除掉破壞化學(xué)反應(yīng)催化劑的物質(zhì)，如加入的蛋白質(zhì)，螯合劑和還原劑。第六章酶分子工程概述專一性的底物和配體酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)物、變構(gòu)效應(yīng)劑、輔酶或輔酶衍生物能與酶緊密結(jié)合，因而使天然酶≒伸展酶之間的平衡向天然酶方向移動(dòng)，從而對(duì)酶的總活力產(chǎn)生有益的影響。如果酶與底物結(jié)合，則得到低內(nèi)能構(gòu)象，產(chǎn)生的復(fù)合物能更好地抵抗變性作用。如果專一性配體不是酶底物，原因可能是由于酶-配體相互作用，也可能是由于酶微環(huán)境的修飾。第六章酶分子工程概述甘油、糖和聚乙二醇是多羥基化合物，能形成很多氫鍵，并有助于形成“溶劑層”，這種酶分子周圍的溶劑層與整體水相不同。它們可增加表面張力和溶液粘度。這類添加劑通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的有效脫水，降低蛋白水解作用而起穩(wěn)定酶的作用。Gekko用低分子量多元醇穩(wěn)定了溶菌酶，發(fā)現(xiàn)變性溫度隨多元醇的濃度和多元醇上羥甲基