酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA法）測定多抗血清(pAb)敏感性，從而篩選出融合備用鼠融合前3～5d腹腔注射OTA的計(jì)量。2、采用間接ELISA法測定pAb效價，采用阻斷ELISA法鑒定pAb敏感性，從而篩選出效價高且IC50（赭曲霉毒素A（OTA）多抗血清對OTA的50%抑制濃度）低的小鼠做細(xì)胞融合備用鼠。3、用間接ELISA和間接競爭ELISA篩選出效價高、敏感性好、細(xì)胞生長旺盛的雜交瘤細(xì)胞株。4、采用間接ELISA法測定單克隆抗體效價，采用阻斷ELISA法測定單克隆抗體敏感性，采用間接ELISA檢測方法進(jìn)行單克隆抗體同種型及亞類鑒定。二、實(shí)驗(yàn)原理ELISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）加以測定。這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。ELISA法根據(jù)種類和變化可分為以下幾類：雙抗體夾心法、間接法、競爭法、阻斷法雙位點(diǎn)一步法、捕獲法測IgM抗體、應(yīng)用親和素和生物素的ELISA。在本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了間接法、阻斷法和競爭法，利用酶分子與小鼠血液中的抗體共價結(jié)合，在底物的作用下，產(chǎn)生顏色反應(yīng)，通過顏色的深淺篩選出融合備用鼠融合前腹腔注射OTA的計(jì)量和效價高且IC50低的小鼠做細(xì)胞融合備用鼠。三、實(shí)驗(yàn)試劑與器材1、實(shí)驗(yàn)試劑在本測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）在此實(shí)驗(yàn)中所采用的免疫吸附劑是1μg/mLOTA-OVA；標(biāo)記物是1:1000倍用含5%豬血清的PBST稀釋的50μL/孔的GAM-IgG-HRP；顯色劑是50μL/孔的TMBOTA、牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清蛋白(OVA)、小鼠單抗同種型檢測試劑盒美國Sigma公司；碳化二亞胺(EDC)英國ThermoScientific公司；弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基1640、選擇培養(yǎng)基HAT、HT、PEG21500美國Invitrogen公司；羊抗鼠酶標(biāo)二抗(GAM-IgG-HRP)華美生物工程有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為重蒸去離子水2、實(shí)驗(yàn)器材U-3000紫外掃描儀日本島津公司；550型酶標(biāo)儀美國Bio-Rad公司；HI9321酸度計(jì)美國Hanna公司；AE260電子天平德國Mettler公司；DK-8D電熱恒溫水槽上海一恒科技有限公司；2-93自動雙重純水蒸餾器、93-3定時恒溫雙向磁力攪拌器上海亞榮生化儀器廠；1201超凈工作臺美國FormaScientific公司；DMI3000B倒置生物顯微鏡德國Leica公司；GS-15R多功能冷凍離心機(jī)美國Beckmen公司；3701型CO2培養(yǎng)箱美國Precision公司；96孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板美國Costar公司；96孔酶標(biāo)板浙江玉環(huán)蘆蒲塑化器械廠。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、間接ELISA①加抗原包被→4℃過夜，洗滌三次、拋干②加待檢血清→37℃2小時，洗滌三次、拋干③加酶標(biāo)抗體→37℃2小時，洗滌三次、拋干④加底物液→37℃30分鐘，加終止液⑤用ELISA檢測儀測定OD值，并計(jì)算出P/N比值。以待測孔OD450nm值≥NCOD450nm值的2.1倍(PC/NC≥2.1)，判為陽性。2、競爭ELISA①1μg/mLOTA-OVA包被→4℃過夜，洗滌三次、拋干②加入待檢抗原及一定量的酶標(biāo)抗原（對照孔僅加酶標(biāo)抗原）→37℃30分鐘，洗滌三次、拋干③加底物液→37℃5分鐘，加終止液④用ELISA檢測儀測定OD值。3、阻斷ELISA①100μl1μg/mLOTA-OVA抗原包被→4℃過夜，洗滌三次、拋干②用200μl阻斷緩沖液進(jìn)行封閉→37℃60分鐘，洗滌三次、拋干③加OD450nm為1.0左右的小鼠血清50μL和不同濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)品(用乙醇溶解，PBS為稀釋液配制)作抑制劑，設(shè)NC和BC→37℃15分鐘，洗滌三次、拋干④加GAM-IgG-HRP，用封閉液1:1000倍稀釋，每孔50μL→37℃30分鐘，洗滌三次、拋干⑤加TMB顯色液50μL/孔→37℃5分鐘，加終止液2mol/LH2SO450μL/孔⑥用ELISA檢測儀測定OD450nm值，3個平行求均值，計(jì)算結(jié)合率。結(jié)合率/%=B/B0×100式中：B0為不加OTA的OD450nm值，B為加OTA的OD450nm值。⑦以結(jié)合率為縱坐標(biāo)，以O(shè)TA質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線趨勢推導(dǎo)回歸方程，計(jì)算OTA多抗血清對OTA的50%抑制濃度(IC50)，以IC50衡量其敏感性。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、篩選出融合備用鼠融合前3～5d應(yīng)腹腔注射50μg/200μLOTA-BSA2、篩選出效價高且IC50低的3號小鼠做細(xì)胞融合備用鼠。3只小鼠血清抗體效價均達(dá)到了10－4，說明獲得了較好的免疫效果，其中3號鼠血清效價較高。同時由圖2可知，3號小鼠的線性回歸直線方程為y＝－0.3311x＋0.8685，從方程可以計(jì)算出3號小鼠多抗的IC50為12.9ng/mL，均低于其他小鼠。3號小鼠的效價較高且IC50最低，選作細(xì)胞融合備用鼠。3、篩選出效價高、抑制效果最好、生長旺盛的1株效果最佳的雜交瘤細(xì)胞株為2A11。4、測定出單克隆抗體對OTA的IC50為112.8pg/mL。制備的抗OTA單克隆抗體的亞型為IgG1型。選取最佳包被質(zhì)量濃度為1μg/mL，最佳抗體工作濃度為1:40000。倍稀釋。六、結(jié)論單抗亞類為IgG1型，間接ELISA效價1:6.4×105，IC50為112.8pg/mL，親和常數(shù)為9.74×1011L/mol，與赭曲霉毒素B交叉反應(yīng)率為