化學(xué)品 水-沉積物系統(tǒng)中穗狀狐尾藻毒性試驗(yàn) 征求意見稿

5GB/TXXXXX—XXXX化學(xué)品水-沉積物系統(tǒng)中穗狀狐尾藻毒性試驗(yàn)本文件描述了化學(xué)品水-沉積物系統(tǒng)中狐尾藻毒性試驗(yàn)的術(shù)語(yǔ)、試驗(yàn)原理、受試物信息、參比物、試驗(yàn)材料和條件、試驗(yàn)程序、質(zhì)量保證與質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果報(bào)告。本文件適用于評(píng)價(jià)化學(xué)品尤其是具有除草活性的化學(xué)品對(duì)生長(zhǎng)在水-沉積物標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)（水、沉積物和營(yíng)養(yǎng)液）中的根系水生植物穗狀狐尾藻活力的影響。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T21801化學(xué)品快速生物降解性呼吸計(jì)量法試驗(yàn)GB/T21802化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的MITI試驗(yàn)（I）GB/T21803化學(xué)品快速生物降解性DOC消減試驗(yàn)GB/T21831化學(xué)品快速生物降解性密閉瓶法試驗(yàn)GB/T21845化學(xué)品水溶解度試驗(yàn)GB/T21852化學(xué)品分配系數(shù)（正辛醇―水）高效液相色譜法試驗(yàn)GB/T21853化學(xué)品分配系數(shù)（正辛醇―水）搖瓶法試驗(yàn)GB/T21855化學(xué)品與pH有關(guān)的水解作用試驗(yàn)GB/T21856化學(xué)品快速生物降解性二氧化碳產(chǎn)生試驗(yàn)GB/T21857化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的OECD篩選試驗(yàn)GB/T22052用液體蒸氣壓力計(jì)測(cè)定液體的蒸氣壓力溫度關(guān)系和初始分解溫度的方法GB/T22228工業(yè)用化學(xué)品固體及液體的蒸氣壓在10-1Pa至105Pa范圍內(nèi)的測(cè)定靜態(tài)法GB/T22229工業(yè)用化學(xué)品固體及液體的蒸氣壓在10-3Pa至1Pa范圍內(nèi)的測(cè)定蒸氣壓平衡法GB/T27850化學(xué)品快速生物降解性通則GB/T42426化學(xué)品蒸氣壓試驗(yàn)OECD化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則No.112水中解離常數(shù)（DissociationConstantsinWater）OECD化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則No.310快速生物降解―密閉瓶二氧化碳法（頂空試驗(yàn)ReadyBiodegradability―CO2inSealedVessels(HeadSpace)］OECD化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則No.316化學(xué)品在水中的光轉(zhuǎn)化直接光解試驗(yàn)（PhototransformationofChemicalsinWater―DirectPhotolysis）3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1水-沉積物系統(tǒng)water-sedimentsystem在實(shí)驗(yàn)室利用水相培養(yǎng)基和人工土建立的水-沉積物試驗(yàn)系統(tǒng)。6GB/TXXXXX—XXXX3.2測(cè)量變量measurementvariable在試驗(yàn)過程中被測(cè)量或被記錄的變量，指穗狀狐尾藻的整株植物的莖長(zhǎng)、莖鮮重和莖干重。3.3平均比生長(zhǎng)率averagespecificgrowthrate試驗(yàn)期間穗狀狐尾藻測(cè)量變量的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)率，用μ表示。3.4生物量增長(zhǎng)量yield試驗(yàn)期間穗狀狐尾藻莖長(zhǎng)、莖鮮重和干重的變化，即一定試驗(yàn)周期內(nèi)（如14d）最終測(cè)量值與最初測(cè)量值之差。3.5響應(yīng)變量responsevariable；穗狀狐尾藻的平均比生長(zhǎng)率和生物量增長(zhǎng)量。4試驗(yàn)原理將健康、未開花的穗狀狐尾藻的頂芽種植于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中，待根系形成后，將植物暴露于一系列受試物濃度或者加標(biāo)沉積物中，在受控的環(huán)境條件下連續(xù)培養(yǎng)14天。受試物對(duì)植物生長(zhǎng)的影響可通過莖長(zhǎng)、莖鮮重和莖干重的定量評(píng)估，以及對(duì)黃化、壞死或生長(zhǎng)畸形等癥狀的定性觀察來確定。通過莖長(zhǎng)、莖鮮重和莖干重計(jì)算平均比生長(zhǎng)率和生物量增長(zhǎng)量，由平均比生長(zhǎng)速率（r）和增長(zhǎng)量（y）分別確定ErCx（例如ErC10、ErC20、ErC50）和EyCx（例如EyC10、EyC20、EyC50根據(jù)需要可通過平均比生長(zhǎng)率和生物量增長(zhǎng)量獲得最低觀察到的效應(yīng)濃度（LOEC）和無觀察到的效果濃度（NOEC）。5受試物信息受試物信息包括：a)按照GB/T21845方法測(cè)定的水中溶解度；b)按照GB/T21852或GB/T21853方法測(cè)定的正辛醇-水分配系數(shù)或關(guān)于分配行為的其他信息；c)按照GB/T21855方法測(cè)定的水解作用或按照OECD化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則No.316測(cè)定的光穩(wěn)定性或在試驗(yàn)用水/試驗(yàn)介質(zhì)中的穩(wěn)定性；d)按照GB/T22052、GB/T22228、GB/T22229、GB/T42426方法測(cè)定的蒸氣壓；e)關(guān)于生物或非生物降解性的信息，如按照GB/T21801、GB/T21802、GB/T21803、GB/T21831、GB/T21856、GB/T21857、GB/T27850或OECD化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則No.310測(cè)定的快速生物降解性試驗(yàn)結(jié)果；f)酸解離常數(shù)，如按照OECD化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則No.112測(cè)定的水中解離常數(shù)；g)應(yīng)具備已知準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度的分析方法，明確體系中受試物的定量限，并提供詳細(xì)的樣品前處理和儲(chǔ)存方法。7GB/TXXXXX—XXXX6參比物定期使用參比物如3,5-二氯苯酚（3,5-DCP）檢查試驗(yàn)程序的有效性。驗(yàn)證試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，3,5-DCP對(duì)穗狀狐尾藻不同響應(yīng)變量的平均EC50值在4.7mg/L～6.1mg/L范圍內(nèi)。建議每年至少對(duì)參比物開展2次試驗(yàn)，如果測(cè)試頻率較低，可在進(jìn)行正式毒性試驗(yàn)的同時(shí)進(jìn)行參比物試驗(yàn)，確保試驗(yàn)方法的有效性。7試驗(yàn)材料和條件7.1儀器設(shè)備除常規(guī)實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備外，還需要以下設(shè)備：a)人工氣候培養(yǎng)箱或生長(zhǎng)室，其日照長(zhǎng)度、光照和溫度應(yīng)可控；b)分析天平；c)pH計(jì)；d)溶解氧測(cè)定儀；e)溫濕度記錄儀；f)照度計(jì)；g)玻璃缸或玻璃燒杯（推薦規(guī)格：2L燒杯，高約24cm，直徑約11cm），試驗(yàn)容器應(yīng)有足夠的水深滿足植物無限生長(zhǎng)，并使植物在整個(gè)試驗(yàn)期間浸沒在水中，其他較大的容器也可適用，其尺寸大小應(yīng)與設(shè)計(jì)的試驗(yàn)體系相符合；h)塑料或玻璃培養(yǎng)缽，其尺寸大小應(yīng)與設(shè)計(jì)的試驗(yàn)體系相符合（在測(cè)試疏水性物質(zhì)或正辛醇-水分配系數(shù)較高的物質(zhì)時(shí)宜選用玻璃材質(zhì)，推薦體積：約500mL，高約8cm，直徑約9cmi)烘干箱。7.2試驗(yàn)生物狐尾藻植株可從野外采集、水生植物供應(yīng)商購(gòu)買和實(shí)驗(yàn)室繁殖獲得，關(guān)于狐尾藻的具體描述見附錄A。如果來源于野外或購(gòu)買獲得，應(yīng)記錄植物的來源，并核實(shí)物種身份。當(dāng)從野外采集狐尾藻時(shí)，應(yīng)確保獲得正確的物種，特別當(dāng)采集地是與其他多葉藻雜交的地區(qū)時(shí)。建議使用經(jīng)過驗(yàn)證的已知來源的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)物，不宜使用污染過的或從已知被污染的地方收集的植物。在試驗(yàn)前，植物應(yīng)在與試驗(yàn)條件相似但不一定完全相同的條件下培養(yǎng)/馴化一段時(shí)間（如大于2周）。開花的培養(yǎng)植物不應(yīng)用于試驗(yàn)，因?yàn)槠湓陂_花期間和開花后營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)速率普遍下降。7.3試驗(yàn)條件在實(shí)驗(yàn)中使用暖和或冷白熒光燈來提供光輻照度（波段范圍為400nm～700nm），水面光照強(qiáng)度為120μE/（m2?s）～160μE/（m2?s），在實(shí)驗(yàn)區(qū)域內(nèi)光照強(qiáng)度的任何偏差不應(yīng)超過±15%。光照和黑暗的時(shí)間比為16h：8h，試驗(yàn)水溫控制在18℃~22℃范圍內(nèi)，植物生長(zhǎng)的最佳pH范圍為7.5～8.0。在試驗(yàn)過程中對(duì)照組pH的增加不應(yīng)超過1.5個(gè)單位，而當(dāng)可以證明滿足規(guī)定的有效性標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，pH變化超過1.5個(gè)單位的偏差不影響試驗(yàn)的有效性。8試驗(yàn)程序8.1試驗(yàn)體系的設(shè)計(jì)8.1.1試驗(yàn)對(duì)照組應(yīng)包含至少6個(gè)平行的試驗(yàn)容器；試驗(yàn)設(shè)置至少5個(gè)濃度，每個(gè)濃度應(yīng)包含至少48GB/TXXXXX—XXXX個(gè)平行的試驗(yàn)容器。如果不需要測(cè)定NOEC，可以改變?cè)囼?yàn)設(shè)計(jì)，增加濃度和減少每個(gè)濃度的平行數(shù)。8.1.2每個(gè)試驗(yàn)容器代表1個(gè)包含3個(gè)頂芽的平行。有下列方法可以確保每個(gè)容器中有3株頂芽：a)試驗(yàn)設(shè)計(jì)A：1株頂芽/培養(yǎng)缽，3個(gè)培養(yǎng)缽/試驗(yàn)容器；b)試驗(yàn)設(shè)計(jì)B：3株頂芽/培養(yǎng)缽，1個(gè)培養(yǎng)缽/試驗(yàn)容器；c)可接受每個(gè)培養(yǎng)缽1株頂芽，每個(gè)容器1個(gè)培養(yǎng)缽的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，但需對(duì)平行數(shù)進(jìn)行調(diào)整以達(dá)到所需的有效性標(biāo)準(zhǔn)。8.1.3每個(gè)試驗(yàn)容器應(yīng)隨機(jī)分配到不同的處理組，對(duì)試驗(yàn)區(qū)域中試驗(yàn)容器的位置進(jìn)行隨機(jī)設(shè)計(jì)，以盡量減少光照強(qiáng)度或溫度的空間差異造成的影響。8.2試驗(yàn)濃度的設(shè)計(jì)8.2.1濃度通常遵循幾何級(jí)數(shù)，試驗(yàn)濃度之間的間隔系數(shù)不應(yīng)超過3.2，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果選擇合適的濃度范圍。8.2.2為了確定ECx，試驗(yàn)濃度應(yīng)包含ECx以確保適當(dāng)?shù)闹眯潘?。例如，最高試?yàn)濃度應(yīng)大于EC50的預(yù)估值。如果EC50值在試驗(yàn)濃度范圍之外，相關(guān)的置信區(qū)間范圍將較大，可能無法對(duì)模型的統(tǒng)計(jì)擬合進(jìn)行有效評(píng)估，設(shè)置更多的試驗(yàn)濃度有利于獲得高質(zhì)量的ECx值置信區(qū)間。8.2.3為了確定LOEC/NOEC(可選終點(diǎn))，最低試驗(yàn)濃度應(yīng)足夠低，以確保處理組植株的生長(zhǎng)與對(duì)照組無顯著性差異。此外，最高試驗(yàn)濃度應(yīng)足夠高，使處理組植株的生長(zhǎng)顯著低于對(duì)照組。設(shè)置更多的平行有利于提高方差分析的統(tǒng)計(jì)能力。8.3限度試驗(yàn)8.3.1當(dāng)預(yù)試驗(yàn)表明,在受試物濃度高達(dá)100mg/L或受試物在試驗(yàn)培養(yǎng)基中達(dá)到其溶解度極限或可分散性極限的情況下對(duì)生長(zhǎng)無不利影響時(shí)，可將100mg/L或受試物溶解度極限或1000mg/kg干沉淀物作為試驗(yàn)濃度，開展包括1個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組在內(nèi)的限度試驗(yàn)。建議將每個(gè)對(duì)照組和試驗(yàn)組的平行數(shù)量增加至不少于6個(gè)試驗(yàn)容器。對(duì)照組和試驗(yàn)組的植物增長(zhǎng)可使用如Student'st檢驗(yàn)比較平均值。8.4試驗(yàn)溶液的配制8.4.1通過稀釋貯備液的方法配制試驗(yàn)溶液，將受試物溶解或分散在Smart–Barko培養(yǎng)基中，使用蒸餾水或去離子水配制。8.4.2最高試驗(yàn)濃度通常不應(yīng)超過受試物的水溶解度，針對(duì)制劑類的受試物，最高試驗(yàn)濃度不應(yīng)超過試驗(yàn)條件下該物質(zhì)的分散性。8.4.3對(duì)低水溶性的受試物，可能需要使用有機(jī)溶劑或分散劑配制貯備液以便將受試物精確地添加到試驗(yàn)介質(zhì)中并幫助其分散和溶解，但應(yīng)盡一切努力避免使用助溶劑或分散劑。使用助溶劑或分散劑不應(yīng)產(chǎn)生植物毒性，常用的助溶劑在濃度達(dá)到100μL/L時(shí)不會(huì)引起植物毒性，如丙酮和二甲基甲酰胺。如果使用助溶劑或分散劑，應(yīng)報(bào)告其最終濃度并保持在最低水平（不大于100μL/L）。此時(shí)，所有的處理組和溶劑對(duì)照組都應(yīng)包含相同濃度的助溶劑或分散劑，不含助溶劑或分散劑的未經(jīng)處理的空白對(duì)照組也需納入到試驗(yàn)設(shè)計(jì)中。關(guān)于助溶劑或分散劑的使用指導(dǎo)可參考OECDNo.23。8.5預(yù)培養(yǎng)階段8.5.1從植株上剪下健康的芽尖/頂芽，無側(cè)枝，長(zhǎng)度為5cm～6cm。對(duì)于試驗(yàn)設(shè)計(jì)A(1株頂芽/培養(yǎng)缽，3個(gè)培養(yǎng)缽/試驗(yàn)容器)，在每個(gè)培養(yǎng)缽內(nèi)植入1株穗狀狐尾藻頂芽；對(duì)于試驗(yàn)設(shè)計(jì)B(3株頂芽/培養(yǎng)缽，1個(gè)培養(yǎng)缽/試驗(yàn)容器)，在每個(gè)培養(yǎng)缽內(nèi)種植4株～5株穗狀狐尾藻頂芽。8.5.2在這兩種情況下(8.5.1)應(yīng)有足量的培養(yǎng)缽植入多余的頂芽以備在試驗(yàn)開始時(shí)選擇生長(zhǎng)一致的植物，以及提供備用植物在試驗(yàn)開始前用于檢查根系的生長(zhǎng)發(fā)育情況，備用植物將在第0d用于莖重量9GB/TXXXXX—XXXX和長(zhǎng)度的測(cè)量。8.5.3頂芽被插入到沉積物表面以下約3cm，至少覆蓋2個(gè)莖節(jié)。將培養(yǎng)缽轉(zhuǎn)移至試驗(yàn)容器中，與試驗(yàn)暴露相同的環(huán)境條件下，在Smart–Barko培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)7天，以誘導(dǎo)根系發(fā)育。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，應(yīng)將多余植株移走，以檢查根系生長(zhǎng)情況。如果根生長(zhǎng)不可見(即根尖不可見)，則應(yīng)將預(yù)培養(yǎng)階段延長(zhǎng)，直至根生長(zhǎng)可見，建議采取該步驟以確保植株在試驗(yàn)啟動(dòng)時(shí)處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。8.5.4對(duì)于試驗(yàn)設(shè)計(jì)A(1株頂芽/培養(yǎng)缽，3個(gè)培養(yǎng)缽/試驗(yàn)容器)，在試驗(yàn)開始前挑選植物生長(zhǎng)一致的培養(yǎng)缽；對(duì)于試驗(yàn)設(shè)計(jì)B(3株頂芽/培養(yǎng)缽，1個(gè)培養(yǎng)缽/試驗(yàn)容器)，多余的植株將被移除，留下三株大小和外觀一致的植株。8.6通過水相的暴露8.6.1根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求，選擇植物生長(zhǎng)一致的培養(yǎng)缽放入試驗(yàn)容器中，將Smart–Barko培養(yǎng)基添加至試驗(yàn)容器中，該操作應(yīng)避免擾動(dòng)沉積物，為此可用漏斗加入培養(yǎng)基（如有需要可在此過程用塑料圓盤覆蓋沉積物，倒入培養(yǎng)基后立即取出或者在添加培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)缽置于試驗(yàn)容器中。應(yīng)盡量減少藻類和細(xì)菌的潛在積聚，如果有必要可在暴露階段開始時(shí)使用新鮮培養(yǎng)基。允許一次性配制好所有平行的受試物試驗(yàn)溶液，在測(cè)試開始時(shí)記錄試驗(yàn)溶液的外觀（如澄清、渾濁等）。8.6.2可先將相應(yīng)量的受試物加入試驗(yàn)培養(yǎng)基中，也可將受試物直接加入到裝有培養(yǎng)基的試驗(yàn)容器中，應(yīng)注意確保受試物均勻地分布在整個(gè)測(cè)試系統(tǒng)中，且不擾動(dòng)沉積物。8.6.3添加培養(yǎng)基前或后，應(yīng)測(cè)量沉積物上方的莖長(zhǎng)。8.7通過沉積物的暴露8.7.1通過直接向新鮮沉積物中添加受試物溶液制備所需濃度的加標(biāo)沉積物，受試物溶解在去離子水中，通過軋機(jī)、攪拌機(jī)或手工攪拌，與配制好的沉積物充分混合。如果受試物難溶于水，可將其溶解在盡可能小體積的合適有機(jī)溶劑中（如正己烷、丙酮或氯仿），將該溶液與約10g細(xì)石英砂混合，待溶劑揮發(fā)后，將沙子與每個(gè)試驗(yàn)容器中適量的沉積物混合，只有易揮發(fā)的溶劑才可用于溶解、分散或乳化受試物。在最終制備沉積物時(shí)，應(yīng)考慮摻有受試物的沙子的體積/重量（即沉積物應(yīng)使用較少的沙子制備）。應(yīng)確保添加到沉積物中的受試物均勻分布。8.7.2將加標(biāo)的沉淀物裝入培養(yǎng)缽中，從預(yù)培養(yǎng)階段中取出生長(zhǎng)一致且具備充足根系的植株植入到加標(biāo)沉積物中。8.7.3將培養(yǎng)缽放入試驗(yàn)容器中，小心地加入Smart-Barko培養(yǎng)基（如使用漏斗避免擾動(dòng)沉積物。8.7.4在添加培養(yǎng)基前或后，測(cè)量沉積物上方的芽長(zhǎng)。8.8試驗(yàn)環(huán)境條件的維持和測(cè)定8.8.1應(yīng)記錄最終溶液體積，并在每個(gè)試驗(yàn)容器上標(biāo)記水位。如果在測(cè)試過程中水分蒸發(fā)超過10%，則應(yīng)補(bǔ)充蒸餾水調(diào)整水位；如有必要，可用透明蓋子（如透明塑料蓋）松散地覆蓋容器，以盡量減少水分蒸發(fā)和藻類的污染。上覆水水深應(yīng)高于沉積物頂部12cm，并應(yīng)分別記錄沉積物的表面積/體積和上覆水面積/體積的比值。8.8.2另外準(zhǔn)備試驗(yàn)容器，加入培養(yǎng)基并置于相同的環(huán)境條件下，用于每天記錄試驗(yàn)容器所在環(huán)境如培養(yǎng)箱、人工氣候室的溫度，或用溫度記錄儀連續(xù)記錄試驗(yàn)環(huán)境中的溫度。8.8.3至少在試驗(yàn)開始、試驗(yàn)期間和結(jié)束時(shí)，在同一時(shí)間測(cè)定所有試驗(yàn)容器的溶解氧和pH。如果試驗(yàn)開始時(shí)（0d）配制不同濃度的試驗(yàn)溶液分裝至不同平行容器中，可只測(cè)定分裝前的不同濃度試驗(yàn)溶液的溶解氧和pH即可。8.8.4在試驗(yàn)開始或試驗(yàn)過程中，至少進(jìn)行1次光照強(qiáng)度的測(cè)定，應(yīng)在生長(zhǎng)箱、培養(yǎng)箱或房間中與容器內(nèi)水位等高的位置上測(cè)定光照強(qiáng)度。光照強(qiáng)度的測(cè)定方法與傳感器的類型相關(guān)，與單向傳感器相比，GB/TXXXXX—XXXX球形傳感器（對(duì)測(cè)量平面上方和下方的所有角度的光作出響應(yīng)）和余弦傳感器（對(duì)測(cè)量平面上方的所有角度的光作出響應(yīng)）更有利于準(zhǔn)確測(cè)定，并且多點(diǎn)光源易給出更高的讀數(shù)結(jié)果。8.9生長(zhǎng)指標(biāo)的分析測(cè)定8.9.1在預(yù)培養(yǎng)階段結(jié)束后至試驗(yàn)開始前（即第0d），從備用的植株中隨機(jī)選擇5個(gè)培養(yǎng)缽（3株/培養(yǎng)缽）或15個(gè)培養(yǎng)缽（1株/培養(yǎng)缽），評(píng)估莖長(zhǎng)、莖鮮重和莖干重。8.9.2當(dāng)植株植入暴露體系后，相關(guān)指標(biāo)測(cè)定如下：a)至少在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)（第14d），測(cè)定和記錄莖長(zhǎng)、側(cè)枝數(shù)量和側(cè)枝的長(zhǎng)度；b)暴露過程中至少觀察和記錄3次（如0d、7d、14d)植物生長(zhǎng)和健康狀況；c)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)（如第14d），測(cè)定和記錄莖的鮮重和干重。8.9.3可使用尺子測(cè)量莖長(zhǎng)，如果存在側(cè)枝，同時(shí)記錄側(cè)枝的數(shù)量和長(zhǎng)度。試驗(yàn)過程中觀察和記錄植物的外觀和試驗(yàn)培養(yǎng)基的狀況以對(duì)植物的健康狀況進(jìn)行評(píng)估。觀察結(jié)果包括：a)黃化，壞死或者其他變色現(xiàn)象如與對(duì)照組植株相比過度變紅；b)細(xì)菌或藻類污染；生長(zhǎng)異常，如發(fā)育遲緩、節(jié)間長(zhǎng)度改變、莖/葉扭曲、側(cè)芽增殖、葉片損失、膨大體損失和莖斷裂；c)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，仔細(xì)清洗根部的沉積物以對(duì)根部系統(tǒng)的健康狀況進(jìn)行評(píng)估，與對(duì)照組相比，是否存在根系缺失、減少、中度發(fā)育或與對(duì)照接近較好的發(fā)育情形。8.9.4在試驗(yàn)的開始和結(jié)束時(shí)，對(duì)莖鮮重進(jìn)行評(píng)估。在沉積物水平上切割枝條，小心去除可能粘附在芽基部的沉積物顆粒，吸干水分后稱鮮重，將植株放入約60℃干燥箱中烘干至恒重，稱量并記錄干重。相關(guān)指標(biāo)的具體測(cè)定時(shí)間見表1。表1相關(guān)指標(biāo)測(cè)定的時(shí)間表0√√√√4――――7―√―√√√√√8.10受試物濃度分析8.10.1應(yīng)通過受試物濃度的分析來確定受試物的正確施用量。在試驗(yàn)開始后不久（穩(wěn)定的受試物于試驗(yàn)當(dāng)天，不穩(wěn)定的受試物于試驗(yàn)開始1h內(nèi)），以及在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采集水樣進(jìn)行濃度分析。8.10.2在試驗(yàn)開始和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)定沉積物和沉積物孔隙水中的受試物濃度，至少測(cè)定最高試驗(yàn)濃度，除非已知受試物在水中穩(wěn)定（大于理論濃度的80%）。如果已有水–沉積物在類似條件下（例如沉積物與水的比例、使用方法、沉積物類型）的研究明確表明受試物在水–沉積物之間的分配行為，則無需對(duì)沉積物和孔隙水進(jìn)行濃度分析。GB/TXXXXX—XXXX8.10.3在試驗(yàn)開始時(shí)對(duì)沉積物取樣很可能會(huì)破壞試驗(yàn)系統(tǒng)，因此需要額外的試驗(yàn)容器用于試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)的濃度分析。如果認(rèn)為有必要進(jìn)行中期評(píng)估，如在第7d進(jìn)行評(píng)估，而分析需要大量難以從測(cè)試系統(tǒng)中獲取的沉積物樣本，則應(yīng)設(shè)置額外的試驗(yàn)容器用于分析測(cè)定。額外試驗(yàn)容器的準(zhǔn)備方式與生物評(píng)估所用的試驗(yàn)容器方式相同。8.10.4可采用10000g，4℃離心30min獲得間隙水，如果已證明受試物不被濾膜吸附，也可采用過濾的方式。如果樣本量太小，可能無法分析孔隙水中的受試物濃度。8.10.5如果受試物濃度在試驗(yàn)期間不能保持在理論濃度的±20%范圍內(nèi)，應(yīng)開展半靜態(tài)試驗(yàn)（如水相暴露在每次更換溶液時(shí)，應(yīng)對(duì)新配制的試驗(yàn)溶液和舊試驗(yàn)溶液進(jìn)行采樣和受試物濃度分析。如果受試物的初始實(shí)測(cè)濃度不能達(dá)到理論濃度的±20%，但有證據(jù)表明初始濃度是可重復(fù)和穩(wěn)定的（即在初始濃度的80%～120%范圍內(nèi)），可只對(duì)最高和最低的試驗(yàn)組進(jìn)行濃度測(cè)定。8.10.6只需對(duì)每個(gè)濃度下的1個(gè)平行容器進(jìn)行受試物濃度的測(cè)定，也可將每個(gè)濃度所有平行的試驗(yàn)溶液混合后用于濃度分析。8.10.7如果已有證據(jù)表明，在整個(gè)試驗(yàn)過程中，受試物的實(shí)測(cè)濃度能夠保持在理論濃度或初始濃度的±20%范圍內(nèi)，可基于理論濃度或初始濃度進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和毒性終點(diǎn)的估算，此時(shí)效應(yīng)濃度應(yīng)基于理論濃度或測(cè)定的初始濃度。如果有證據(jù)表明受試物濃度在試驗(yàn)過程中出現(xiàn)了下降（即在處理組中不能保持在理論濃度或初始濃度的±20%以內(nèi)），應(yīng)基于暴露期間實(shí)測(cè)濃度的時(shí)間加權(quán)平均值或受試物濃度下降模型對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，更多的關(guān)于受試物效應(yīng)濃度的計(jì)算可參考OECDNo.23。9質(zhì)量保證與質(zhì)量控制如滿足以下條件，試驗(yàn)結(jié)果有效。a)試驗(yàn)期間，對(duì)照組的平均總莖長(zhǎng)和莖總鮮重至少是試驗(yàn)開始時(shí)的2倍。b)對(duì)照組植物不得出現(xiàn)任何黃化的癥狀，沉積物和試驗(yàn)培養(yǎng)基無明顯藻類和/或細(xì)菌等其他生物的污染。c)從試驗(yàn)開始到試驗(yàn)結(jié)束，對(duì)照組平行之間植物莖鮮重生物量變異系數(shù)的平均值不超過35%。10數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)10.1響應(yīng)變量10.1.1如果使用了助溶劑或分散劑，助溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組的結(jié)果在統(tǒng)計(jì)上無顯著性差異時(shí)，助溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組的數(shù)據(jù)可合并用于統(tǒng)計(jì)分析。采用平均比生長(zhǎng)率和生物量增長(zhǎng)量?jī)蓚€(gè)響應(yīng)變量評(píng)估受試物對(duì)植物生長(zhǎng)的影響。10.1.2平均比生長(zhǎng)率是基于對(duì)照組和每個(gè)處理組的總莖長(zhǎng)、總莖鮮重和總莖干重隨時(shí)間的對(duì)數(shù)變化。對(duì)照組和處理組的每個(gè)平行均需統(tǒng)計(jì)，按照公式(1)計(jì)算每個(gè)試驗(yàn)容器（平行）的3株植物的平均長(zhǎng)度和重量以及隨后每個(gè)平行的生長(zhǎng)速率。μi?j=…………（1）式中：——從i時(shí)間到j(luò)時(shí)間的平均比生長(zhǎng)率；Ni——在時(shí)間i時(shí)處理組或?qū)φ战M的測(cè)量變量；Nj——在時(shí)間j時(shí)處理組或?qū)φ战M的測(cè)量變量；GB/TXXXXX—XXXXt——從i到j(luò)的時(shí)間，單位為天(d)。10.1.3應(yīng)計(jì)算整個(gè)試驗(yàn)周期每個(gè)處理組和對(duì)照組中的生長(zhǎng)率平均值和方差值，按照公式(2)計(jì)算每個(gè)試驗(yàn)濃度（處理組）的生長(zhǎng)抑制百分率（Ir）?！?00…………(2)式中：Ir——平均比生長(zhǎng)率的抑制率，單位為百分率(%);μc——空白對(duì)照組的平均比生長(zhǎng)率；μt——處理組的平均比生長(zhǎng)率。10.1.4基于對(duì)照組和每個(gè)處理組總莖長(zhǎng)、總莖鮮重和總莖干重隨時(shí)間的變化，按照公式（3）計(jì)算生物量增長(zhǎng)量抑制百分率（Iy）。%Iy=×100…………（3）式中：Iy——生物量抑制百分率，單位為百分率(%);bc——空白對(duì)照組最終生物量與初始生物量之差；bt——處理組的最終生物量與初始生物量之差。10.2濃度–效應(yīng)曲線10.2.1根據(jù)上述的穗狀狐尾藻的平均比生長(zhǎng)率抑制率（Ir）和生物量增長(zhǎng)量抑制率（Iy）繪制受試物的濃度對(duì)數(shù)-效應(yīng)曲線。10.2.2基于總莖鮮重、總莖干重和總莖長(zhǎng)的平均比生長(zhǎng)率（ErCx）和生物量增長(zhǎng)量（EyCx）分別估算ECx。應(yīng)該注意的是，使用這兩個(gè)響應(yīng)變量計(jì)算獲得的ECx值不具有可比較性。由于各自方法的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)不同，在遵守本文件測(cè)試條件下，基于平均比生長(zhǎng)率的ECx值（ErCx）在大多數(shù)情況下高于基于生物量的ECx值（EyCx這種差異不是兩個(gè)響應(yīng)變量之間的敏感性差異，僅在數(shù)值上存在區(qū)別。10.2.3通過回歸分析獲得定量的濃度-響應(yīng)關(guān)系，在對(duì)響應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性化轉(zhuǎn)換后，可使用加權(quán)線性回歸，例如將其轉(zhuǎn)換為probit、logit或Weibull單位，但非線性回歸是處理數(shù)據(jù)不規(guī)則和偏離平滑分布的首選方法，接近零抑制或完全抑制時(shí)，這種不規(guī)則會(huì)被轉(zhuǎn)換放大，干擾統(tǒng)計(jì)分析。probit、logit或Weibull轉(zhuǎn)換的標(biāo)準(zhǔn)分析方法適用于不連續(xù)的數(shù)據(jù)（如死亡率或生存率而更多關(guān)于如生長(zhǎng)率或生物量之類的連續(xù)數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換方法可參考指南文件OECDNo.54。10.2.4對(duì)于每個(gè)需要分析的響應(yīng)變量，使用濃度-響應(yīng)關(guān)系計(jì)算ECx值的點(diǎn)估計(jì)值，確定其95%置信限，并應(yīng)以圖形或統(tǒng)計(jì)的方式評(píng)估響應(yīng)數(shù)據(jù)對(duì)回歸模型的擬合度。回歸分析應(yīng)使用每個(gè)平行的效應(yīng)值，而不是處理組的平均值。如果可用的回歸模型/方法對(duì)數(shù)據(jù)不適用，也可使用線性插值方法獲得EC50值和置信限。10.2.5使用方差分析方法（ANOVA）對(duì)每個(gè)處理組的平均值與空白組的平均值進(jìn)行比較，通過適當(dāng)?shù)谋容^方法（如Dunnett′s,Williams′stest）獲得LOEC和NOEC。采用Shapiro-Wilks-test或Levene′stest統(tǒng)計(jì)方法，通過方差分析假設(shè)正態(tài)分布和方差齊性是否成立，不滿足正態(tài)分布和方差齊性的假GB/TXXXXX—XXXX設(shè)可通過數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)變換來校正。如果方差不齊和/或與偏離正態(tài)分布，且不能通過變換加以校正，則應(yīng)考慮采用Bonferroni-Welch-test、step-downJonkheereTerpstratest、Bonferroni-Median-Test等方法進(jìn)行分析。11結(jié)果報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容。a)受試物：1)單組分物質(zhì)：物理性狀、水溶解性及相關(guān)的物理化學(xué)性質(zhì)；化學(xué)標(biāo)識(shí)，如國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）名稱或CAS名稱、CAS號(hào)、簡(jiǎn)化分子線性輸入規(guī)范（SMILES）碼或國(guó)際化合物標(biāo)識(shí)（InChI）碼、結(jié)構(gòu)式、純度等信息，在適當(dāng)情況下還應(yīng)提供雜質(zhì)的化學(xué)鑒別信息；2)多組分物質(zhì)、不明復(fù)雜物質(zhì)（UVCBs組分未知或者可變的物質(zhì)、復(fù)雜反應(yīng)產(chǎn)物或者生物材料）和混合物：盡可能提供各組分的化學(xué)鑒別信息（如上）、含量和相關(guān)的物理-化學(xué)特性；b)測(cè)試物種：科學(xué)名稱和來源。c)試驗(yàn)條件：1)培養(yǎng)階段的條件和周期；2)試驗(yàn)方式（如靜態(tài)、半靜態(tài)、脈沖式）；3)試驗(yàn)開始的時(shí)間和周期；4)試驗(yàn)培養(yǎng)基的組成，如沉積物和液體營(yíng)養(yǎng)成分；5)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，如植物生長(zhǎng)的空間/實(shí)驗(yàn)室、試驗(yàn)容器、試驗(yàn)體積、試驗(yàn)開始時(shí)每個(gè)試驗(yàn)容器植物的長(zhǎng)度和重量、沉積物和水的表面積比、沉積物和水的體積比；6)試驗(yàn)濃度（理論濃度或者實(shí)測(cè)濃度），每個(gè)濃度處理組的平行數(shù)；7)受試物貯備液和試驗(yàn)溶液的配制方法，使用的助溶劑或分散劑（如有）；8)試驗(yàn)溫度；9)光照源，輻照強(qiáng)度；10)試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)的pH，溶液狀態(tài)；11)溶解氧；d)分析方法：測(cè)定長(zhǎng)度、鮮重和干重的方法。e)統(tǒng)計(jì)方法：使用合適的分析方法評(píng)估數(shù)據(jù)的質(zhì)量，檢驗(yàn)方法、分析的標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間。f)結(jié)果：1)根據(jù)表1中提供的評(píng)估時(shí)間表，在每次觀察和分析時(shí)，每個(gè)處理組和對(duì)照容器中植物/培養(yǎng)缽的莖長(zhǎng)和莖鮮重以及其他測(cè)量變量；2)每個(gè)測(cè)量變量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差；3)每個(gè)濃度的生長(zhǎng)曲線；4)基于莖長(zhǎng)和鮮重的雙倍對(duì)照生長(zhǎng)速率，包括生物鮮重增長(zhǎng)量的變異系數(shù)；；5)計(jì)算每個(gè)處理組響應(yīng)變量，包括不同平行之間的平均值和變異系數(shù)；6)濃度-效應(yīng)關(guān)系圖；7)估算響應(yīng)變量（如EC50）的毒性終點(diǎn)和相關(guān)置信區(qū)間，如果計(jì)算LOEC和/或NOEC，提供統(tǒng)計(jì)方法。8)如果使用了方差分析，則可以檢測(cè)到的效應(yīng)大?。ɡ缱钚★@著差異）；9)濃度組可觀察到的任何生長(zhǎng)刺激效應(yīng)；GB/TXXXXX—XXXX10)任何可見的植物毒性跡象以及對(duì)試驗(yàn)溶液的觀察；11)討論結(jié)果，包括偏離本文件對(duì)測(cè)試結(jié)果的任何影響。GB/TXXXXX—XXXXA穗狀狐尾藻的描述A.1本文件中描述的方法主要針對(duì)穗狀狐尾藻，也可用于測(cè)試一系列水生植物物種。穗狀狐尾藻屬于雙子葉植物綱，小二仙草科，是一種多年生沉水植物。穗狀狐尾藻為世界廣泛分布，產(chǎn)于全球的淡水水域，可以耐受各種條件，在靜態(tài)和流動(dòng)的水體中均可生長(zhǎng)。A.2冬天枝葉枯萎，根部埋在沉積物中，來年春天再次發(fā)芽生長(zhǎng)。狐尾藻植株通常能自由開花和結(jié)果，從自然脫落的斷枝或根狀莖進(jìn)行無性繁殖，是狐尾草繁殖的主要方法。A.3冬季不容易獲得狐尾藻的地區(qū)，可能需要在溫室或?qū)嶒?yàn)室條件下長(zhǎng)期貯備培養(yǎng)。雖然可降低輻照度和溫度以減少培養(yǎng)液更新的頻率（例如當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)沒有計(jì)劃進(jìn)行狐尾藻試驗(yàn)時(shí)但貯備培養(yǎng)物應(yīng)保持在與試驗(yàn)條件相似的條件下，且建議使用比試驗(yàn)中更大的水族箱或培養(yǎng)缽，以留出足夠繁殖空間。沉積物和水介質(zhì)的組成應(yīng)與試驗(yàn)中使用的相同，也可使用其他沉積物施肥的方法（例如使用商業(yè)緩釋肥A.4貯備培養(yǎng)物應(yīng)不受到任何其他生物體的污染，包括蝸牛、絲狀藻類、真菌和昆蟲，如：飛蛾的卵或幼蟲以及象甲的幼蟲或成蟲，有必要用淡水沖洗植物以消除可見的污染。此外，盡管植物不需要完全無菌，應(yīng)盡量減少單細(xì)胞藻類和細(xì)菌的污染。應(yīng)對(duì)貯備培養(yǎng)的植物進(jìn)行檢測(cè)，必要時(shí)進(jìn)行移植，以避免藻類和細(xì)菌污染的發(fā)展。當(dāng)藻類或細(xì)菌污染成為問題時(shí)，對(duì)貯備培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行通氣可能起到效果。GB/TXXXXX—XXXX培養(yǎng)基和沉積物的配制B.1Smart-Barko培養(yǎng)基宜使用Smart-Barko培養(yǎng)基培養(yǎng)穗狀狐尾藻和進(jìn)行毒性試驗(yàn)，用去離子水或蒸餾水配制Smart-Bar