流式細(xì)胞分析分選原理課件

流式細(xì)胞儀工作原理

流式細(xì)胞分析分選原理流式細(xì)胞術(shù)的原理流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是一種能對單個細(xì)胞、分子和生物顆粒（微生物）進(jìn)行多參數(shù)快速檢測的新型分析和分選技術(shù)。近幾年隨著多種單克隆抗體的成功制備和多種熒光素的應(yīng)用。FCM逐步運(yùn)用于對疾病診斷和治療監(jiān)測的臨床檢驗常規(guī)工作。流式細(xì)胞分析分選原理流式細(xì)胞儀與顯微鏡光源激光自然光、燈光、氙(汞)燈對象細(xì)胞、生物粒子細(xì)胞、生物粒子承載工具載(蓋)玻片鞘液及流動室檢測信號光學(xué)信號形態(tài)及染色放大方式PMT，放大電路目鏡X物鏡統(tǒng)計人工，200計算機(jī)，>5000結(jié)果簡單，單參數(shù)多參數(shù)，綜合分析流式細(xì)胞分析分選原理基本原理流路流動室 鞘液SHEATH樣本流SAMPLE單細(xì)胞懸液5*105~1*106個/ml光路光源檢測信號光電倍增管PMTHV電路放大電路HV及GAIN增益A/D轉(zhuǎn)換統(tǒng)計：計算機(jī)流式細(xì)胞分析分選原理流式細(xì)胞儀光路流路電子軟件流式細(xì)胞分析分選原理流路光路電路/電子軟件流式細(xì)胞分析分選原理流路單細(xì)胞懸液大多數(shù)儀器是在50-300μm大小的孔徑中,將細(xì)胞懸液注射進(jìn)入鞘液中這一過程,成為流體動力學(xué)聚焦流式細(xì)胞分析分選原理FLOWCELLInjector

TipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheath

fluid流式細(xì)胞分析分選原理流路光路電路/電子軟件流式細(xì)胞分析分選原理光路光源檢測信號散射光信號

FS:前向角散射光

SS:側(cè)向角散射光(90度散射光)熒光信號 熒光染料 光學(xué)濾片

顏色補(bǔ)償流式細(xì)胞分析分選原理光路光源 與通過的細(xì)胞聚焦在同一點上激光 空冷 488nmblue,633nmred,325nmUV,514nmgreen,水冷Innova300系列 Innova70系列固態(tài)流式細(xì)胞分析分選原理檢測信號流式細(xì)胞分析分選原理

散射光信號—前向散射光(FS)FSForward

(AngelLight)Scatter

在激光束正前方的檢測器,為前向散射光檢測器

FS的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒的大小,形狀及opticalhomogeneity有關(guān)FS用于檢測細(xì)胞或其他粒子的表面屬性 如:大小流式細(xì)胞分析分選原理前向散射光流式細(xì)胞分析分選原理流式細(xì)胞分析分選原理散射光信號–側(cè)向散射光SS-Side

(AngelLight)Scatter

與激光束垂直方向的檢測器為側(cè)向檢測器,也稱為90度散射光檢測器

SS的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒的大小,形狀及opticalhomogeneity有關(guān)SS用于檢測細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu) 如:胞漿內(nèi)顆粒多少,核質(zhì)比流式細(xì)胞分析分選原理側(cè)向散射光流式細(xì)胞分析分選原理流式細(xì)胞分析分選原理流式細(xì)胞分析分選原理90DegreeScatter02004006008001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSideScatterProjectionLightScatterGatingScale流式細(xì)胞分析分選原理光路-熒光信號每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長,并激發(fā)后會有發(fā)射波長,流式細(xì)胞儀檢測的即是它特定的發(fā)射波長.利用各種不同波長的光學(xué)濾片來收集(檢測)這些光學(xué)信號流式細(xì)胞分析分選原理熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)流式細(xì)胞分析分選原理Fluorescenceemittedbyeachfluorochromeisusuallydetectedinauniquefluorescencechannel.Thespecificityofdetectioniscontrolledbythewavelengthselectivityofopticalfiltersandmirrors.流式細(xì)胞分析分選原理Absorptionspectrum:RangeoverwhichafluorescencecompoundmaybeexcitedEmissionspectrum:Rangeofemittedwavelengthsforaparticularcompound流式細(xì)胞分析分選原理5ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC5/PC7流式細(xì)胞分析分選原理4ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC5流式細(xì)胞分析分選原理常用熒光染料的特性熒光染料激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光紅PI488620DNA染色橙紅PECy7 488 755 免疫熒光 深紅PerCP 488 670APC633 670流式細(xì)胞分析分選原理光路-濾片特性當(dāng)以45o

角放置濾片時,該濾片可以通過一定波長的光,同時也可以阻斷并折射該波長以下的光

這種方式的濾片稱為二向色性濾片(dichroicfilter)

流式細(xì)胞分析分選原理標(biāo)準(zhǔn)帶通濾片bandpass光源通過的光譜630/30nmBP615-645nmlight

流式細(xì)胞分析分選原理SourcelightPassedlightCertaincolorsabsorbedAbsorbancefilter流式細(xì)胞分析分選原理流式細(xì)胞分析分選原理488DL488BK550DL525BP600DL575BP640DL620BP675BP流式細(xì)胞分析分選原理Unique4-ColorSingleLaserDesignAir-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(RD1)620BPFL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL流式細(xì)胞分析分選原理PC7Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(RD1)675BP(PC5)750BPFL4(PC7)488DL488BK550DL600DL700DL流式細(xì)胞分析分選原理流式細(xì)胞分析分選原理WithThankstoDr.FrankSchniedersGentherapieGruppe–AbteilungMolekulareZellbiologieInstitutfürMedizinischeBiochemieundMolekularbiologieUniversit?tsklinikumHamburg-EppendorfEGFP,EYFPand7-AADWithEPICS?XLTMandEXPO32TMADC-SoftwareHEK293HumanEmbryonalKidneyCells293FilterSetBP510LAF21BP550LAF30DichroicMirror525DRLPCellViabilitywith7-AADHEK293-cellswithEYFPTransfectionHEK293-cellswithEGFPTransfectionMixtureofEGFP-andEYFP-transfectedHEK293-CellsEGFP...EnhancedGreenFluorescentProtein(Ex488;Em507nm)EYFP...EnhancedYellowFluorescentProtein(Ex513;Em527nm)7-AAD...7-Aminoactinomycin(ViabilityStain;Ex546;Em647nm)流式細(xì)胞分析分選原理emissionintensitywavelengthFLBFLA顏色補(bǔ)償流式細(xì)胞分析分選原理減法顏色補(bǔ)償減法補(bǔ)償去除疊加信號,在使用雙色以上時會產(chǎn)生減得過多的錯誤BDFACSCalibur補(bǔ)償試劑FITCPECorrectOver-compFITCPEUnder-compFITCPE流式細(xì)胞分析分選原理全矩陣顏色補(bǔ)償全矩陣在每個PMT上對于每一個熒光計算“疊加熒光素”的比率通過矩陣去除或加上信號EPICSXLCytomicsFC500Gallios/NaviosCD45-ECD流式細(xì)胞分析分選原理流路光路電路/電子軟件流式細(xì)胞分析分選原理電路及電子系統(tǒng)-光電倍增管Photomultipliertube(PMT)

將光學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖(數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù))信號

流式細(xì)胞分析分選原理不同的脈沖信號被轉(zhuǎn)換成數(shù)字通道(CHANNEL)的過程

流式細(xì)胞分析分選原理流式細(xì)胞分析分選原理單參數(shù)直方圖流式細(xì)胞分析分選原理流式細(xì)胞分析分選原理流路光路電路/電子軟件流式細(xì)胞分析分選原理軟件基于Windows平臺軟件界面簡單，易學(xué)易用目前流式獲取和分析最友好的軟件包，涵蓋所有數(shù)據(jù)和圖形處理功能易于與醫(yī)院內(nèi)LIS系統(tǒng)相連直觀拖拽方式調(diào)節(jié)電壓、補(bǔ)償，支持時時/自動/脫機(jī)補(bǔ)償支持多文件分析報告，內(nèi)置FlowPage功能，方便中文臨床報告的生成和輸出PRISM濃縮柱形圖功能便于結(jié)果統(tǒng)計，兼容Office，支持PDF內(nèi)置質(zhì)控功能流式細(xì)胞分析分選原理Quickset——直觀的電壓調(diào)節(jié)流式細(xì)胞分析分選原理QuickComp——直觀的補(bǔ)償調(diào)節(jié)補(bǔ)償前補(bǔ)償后流式細(xì)胞分析分選原理PRISM濃縮柱形圖

一張圖上顯示多達(dá)1024個表型組合結(jié)果（十色分析，210分析組合）將實驗所分析的所有細(xì)胞數(shù)據(jù)結(jié)果簡單地濃縮在一張直方圖上能直接讀出各種陰性或陽性組合的結(jié)果清晰直觀且便于數(shù)據(jù)的保存顏色點圖組合21223323462451025615267212