第四章動(dòng)物干細(xì)胞

第四章動(dòng)物干細(xì)胞第一節(jié)干細(xì)胞的概念和分類(lèi)一、概念干細(xì)胞（Stemcell）是一類(lèi)具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞,能產(chǎn)生表型和基因型與自己完全相同的子細(xì)胞，并具有不同分化潛能。胚胎干細(xì)胞形態(tài)特征：圓形或橢圓形，體積小，核質(zhì)比大；生化特征：較高的端粒酶活性；一般都有獨(dú)特的表面標(biāo)志；增殖特征:自穩(wěn)定性：?jiǎn)渭?xì)胞或無(wú)脊椎動(dòng)物——不對(duì)稱(chēng)分裂哺乳動(dòng)物——種群意義上的不對(duì)稱(chēng)分裂分化特征：是干細(xì)胞最重要的特征。干細(xì)胞本生不是終末分化細(xì)胞，具有再分化的潛力。干細(xì)胞的主要生理特征：二、分類(lèi)一）根據(jù)發(fā)生來(lái)源分類(lèi)胚胎干細(xì)胞：成體干細(xì)胞：來(lái)自早期胚胎（ESC）、原始生殖細(xì)胞（PGC）、或畸胎瘤組織（EC）等如骨髓造血干細(xì)胞（HSC），間質(zhì)干細(xì)胞（MSC），神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）ESC什么是畸胎瘤如果在胚胎不同時(shí)期，某些多能細(xì)胞從整體上分離或脫落下來(lái)，使細(xì)胞基因發(fā)生突變，分化異常，則可發(fā)生胚胎異常。一般認(rèn)為，這種分離或脫落發(fā)生于胚胎早期，則形成畸胎；而如發(fā)生于胚胎后期，則形成了具有內(nèi)胚層、中胚層和外胚層三個(gè)胚層的異常分化組織，即形成了畸胎瘤。鼻咽畸胎瘤淋巴管瘤生殖嵴與PGC（原始生殖細(xì)胞）成體干細(xì)胞：神經(jīng)干細(xì)胞二）根據(jù)分化潛能分類(lèi)全能干細(xì)胞：如ESC多能干細(xì)胞：如造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞定向祖細(xì)胞：如造血母細(xì)胞等。專(zhuān)能干細(xì)胞：皮膚干細(xì)胞，成肌細(xì)胞等三）根據(jù)干細(xì)胞存在的組織器官分類(lèi)胚胎干細(xì)胞造血干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞肝臟干細(xì)胞皮膚干細(xì)胞肌肉干細(xì)胞等第二節(jié)胚胎干細(xì)胞通過(guò)建立體外培養(yǎng)的方法，獲得保持增殖且不分化的胚胎干細(xì)胞系的技術(shù)稱(chēng)為胚胎干細(xì)胞的建系。一、胚胎來(lái)源的干細(xì)胞系（p132圖6-1）1.囊胚階段的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）2.來(lái)源于生殖嵴部位的原始生殖細(xì)胞（PGC）3.來(lái)源于畸胎瘤組織（EC）二、胚胎干細(xì)胞的建系主要步驟包括：1.培養(yǎng)體系的選擇和準(zhǔn)備2.胚胎采集3.ICM的獲取4.ICM的離散5.ESC的建系1.培養(yǎng)體系的選擇和準(zhǔn)備飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備：飼養(yǎng)層細(xì)胞一方面對(duì)ESC細(xì)胞帖壁起支持作用，另一方面其分泌蛋白可抑制ESC分化，維持其增殖特性和多能性。常用飼養(yǎng)層細(xì)胞為成纖維細(xì)胞（如STO成纖維細(xì)胞系）、子宮內(nèi)皮細(xì)胞、3T3細(xì)胞株等。為了阻斷飼養(yǎng)層細(xì)胞的分裂，而不影響其分泌蛋白的產(chǎn)生，通常采用γ射線或絲裂霉素C處理之。培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：用DMEM（高糖）培養(yǎng)液，其中胎牛血清的濃度和質(zhì)量很重要，還要加非必須氨基酸；β-巰基乙醇。常采用添加LIF等抑制ESC的分化潛能；添加EGF等生長(zhǎng)因子來(lái)促進(jìn)ESC的增殖。LIF抑止胚胎干細(xì)胞分化的信號(hào)通路LIF干細(xì)胞表面的LIF受體和gp130蛋白形成異二聚體激活JAK酪氨酸激酶系統(tǒng)激活MAP激酶ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)和STAT3蛋白

STAT3形成同型二聚體入核

激活核內(nèi)靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)相應(yīng)蛋白抑止ESC的分化

2.胚胎的采集一般囊胚期胚胎或后桑葚胚。3.ICM的獲取1）直接分離法：囊胚于飼養(yǎng)層上自行發(fā)育成孵化囊胚，待ICM擴(kuò)大增殖時(shí)挑取?；蚴褂面溍沟鞍酌柑幚鞿P，獲得裸胚培養(yǎng)。2）免疫分離法：鏈霉蛋白酶去除囊胚晚期胚泡ZP，依次轉(zhuǎn)移至補(bǔ)體滅活和未滅活的抗血清中，去除滋胚層細(xì)胞后，吸取ICM，移至飼養(yǎng)層培養(yǎng)。4.ICM的離散胰蛋白酶消化即可離散ICM。5.胚胎干細(xì)胞建系三、胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用第三節(jié)、胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性與鑒定方法一、生物學(xué)特性增殖與分化特征：永生化(immortal)；能維持穩(wěn)定的正常的二倍體染色體結(jié)構(gòu)；有穩(wěn)定的發(fā)育潛能，能被誘導(dǎo)增殖或分化；能參與胎兒所有組織的發(fā)育過(guò)程；形態(tài)特征體積小、核大，有一個(gè)或多個(gè)核仁；胚胎干細(xì)胞克隆緊密堆積，細(xì)胞之間無(wú)明顯的界限，細(xì)胞克隆有一定形狀規(guī)律。生化特征具有堿性磷酸酶和端粒酶活性；表達(dá)SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60等表面標(biāo)志；表達(dá)OCT-4蛋白；人胚胎干細(xì)胞的表面標(biāo)志Otc4基因Otc4基因被認(rèn)為在整個(gè)卵子生成和囊胚附殖前以及早期外胚層中都表達(dá)，是受精卵全能性的關(guān)鍵。Otc4基因只能在胚胎中才能得到完全表達(dá)，而在成體動(dòng)物體細(xì)胞中的表達(dá)基本上被關(guān)閉。這就意味著克隆人技術(shù)的第一步就存在很大問(wèn)題。所以O(shè)tc4也被稱(chēng)為克隆人終結(jié)者。二、胚胎干細(xì)胞的鑒定方法1.形態(tài)鑒定：核質(zhì)比大，體積小，細(xì)胞集落小鼠呈鳥(niǎo)巢狀，牛、豬等呈饅頭狀，人呈扁平、松散聚合體。2.核型分析：二倍體核型，染色體受損情況等。3.ESC特異性表面抗原表達(dá)的鑒定：小鼠ESC以SSEA-1為主，人以SSEA-3、SSEA-4為主。此外，ALP、Otc-4等都可作為表面標(biāo)志。4.端粒酶活性鑒定：端粒長(zhǎng)度及端粒酶活性檢測(cè)。5.體內(nèi)外分化能力鑒定：體內(nèi)外分化能力鑒定：胚胎小體（EB，或稱(chēng)擬胚體）改變細(xì)胞的培養(yǎng)條件:改變細(xì)胞的培養(yǎng)條件是ES細(xì)胞定向分化的基本策略,常用的方法有:與輔助細(xì)胞共培養(yǎng);在半固體培養(yǎng)基中原位生長(zhǎng)分化;添加生長(zhǎng)因子、化學(xué)誘導(dǎo)劑等。導(dǎo)入外源性基因,使其分化為某一特定類(lèi)型的細(xì)胞。體內(nèi)定向分化,使ES細(xì)胞多數(shù)分化為該組織特異性的細(xì)胞。三、胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的方法胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化：

胎牛血清，骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－

造血細(xì)胞

RA胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－神經(jīng)細(xì)胞

DMSO胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－肌肉細(xì)胞

TGF-B1,VEGF,bFGF胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－血管和內(nèi)皮細(xì)胞

RA+胰島素+T3胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－脂肪細(xì)胞

BMP-2,BMP-4胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－軟骨細(xì)胞

地塞米松，磷酸甘油胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－骨細(xì)胞

基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－胰島素分泌細(xì)胞人胚胎干細(xì)胞注射至免疫缺陷小鼠的后腿肌肉中形成的各種組織：（a）腸樣結(jié)構(gòu)；(b)神經(jīng)上皮花結(jié)；(c）骨骼；(d)軟骨；(e)橫紋?。?f)腎。A.小鼠成纖維飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)8天后的ICM（標(biāo)尺＝100um）B.ICM中分離出的H9細(xì)胞系（標(biāo)尺＝100um）C.H9細(xì)胞系（標(biāo)尺＝50um）D.在無(wú)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，但有LIF（20ng/ml）的條件下培養(yǎng)5d后，H9細(xì)胞發(fā)生分化（標(biāo)尺＝100um）第四節(jié)、成體干細(xì)胞一、概念和生物學(xué)特征概念：指一群分布在成體組織中尚未分化的、具有自我更新、并負(fù)有構(gòu)建和補(bǔ)充某種組織的各種類(lèi)型細(xì)胞潛能的干細(xì)胞。生物學(xué)特征：1、慢周期性2、自我更新和再生能力的有限性3、不對(duì)稱(chēng)分裂4、細(xì)胞鑒定標(biāo)志造血干細(xì)胞是體內(nèi)各種血細(xì)胞的唯一來(lái)源，它主要存在于骨髓、外周血、臍帶血中。造血干細(xì)胞的移植是治療血液系統(tǒng)疾病、先天性遺傳疾病以及多發(fā)性轉(zhuǎn)移性腫瘤疾病的最有效方法。與骨髓移植和外周血干細(xì)胞移植相比，臍血干細(xì)胞移植的長(zhǎng)處在于無(wú)來(lái)源的限制，對(duì)HLA配型要求不高，不易受病毒或腫瘤的污染。造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞的來(lái)源骨髓；1/400外周血；1/100000臍帶血；1/10000胎兒造血系統(tǒng)；胚胎干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞。二、成體干細(xì)胞的分離與鑒定（以HSC為例）無(wú)菌采集骨髓低滲處理密度梯度離心獲單核細(xì)胞CD34抗體標(biāo)記流式細(xì)胞儀分離結(jié)合免疫吸附分離鑒定。CulturingHematopoieticStemCell造血干細(xì)胞的體外培養(yǎng)如造血干細(xì)胞的鑒定：細(xì)胞形態(tài)：集落呈非貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)較小細(xì)胞表面標(biāo)志：flk-1（FetalLiverKinase1);L/TAL-1；CD34；GATA-1；基因表達(dá)：TAL-1；GATA-2；βH1；β主要珠蛋白體外移植：漿細(xì)胞移植給患者能恢復(fù)造血功能，并且二次移植仍可重建造血系統(tǒng)。造血干細(xì)胞的移植移植前處理:超大劑量的放療、化療盡量消滅腫瘤細(xì)胞，同時(shí)抑制患者的免疫系統(tǒng)，使供體者的造血干細(xì)胞可以順利植入。采集供體者的造血干細(xì)胞（骨髓、外周血、臍帶血），并與受體進(jìn)行HLA配型；將造血干細(xì)胞輸入到受體者體內(nèi)，造血干細(xì)胞會(huì)自動(dòng)定居到脊髓。三、成體干細(xì)胞的應(yīng)用：細(xì)胞移植技術(shù)細(xì)胞類(lèi)型

治療的疾病神經(jīng)細(xì)胞

中風(fēng)、帕金森氏病、老年癡呆癥、脊髓損傷、多發(fā)性硬化病 心肌細(xì)胞

心臟病發(fā)作、充血性心臟病產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞糖尿病軟骨細(xì)胞 骨性關(guān)節(jié)炎血細(xì)胞 癌癥、免疫缺乏癥、遺傳學(xué)血液病、白血病肝細(xì)胞 肝炎、肝硬化皮膚細(xì)胞 燒傷骨細(xì)胞 骨質(zhì)疏松癥視網(wǎng)(眼)細(xì)胞 黃斑癥骨骼肌細(xì)胞 肌肉萎縮癥四、干細(xì)胞技術(shù)研究面臨的問(wèn)題

l用于干細(xì)胞研究的胚胎來(lái)源困難;

l如何保持干細(xì)胞的全能性，并控制向特別類(lèi)型細(xì)胞轉(zhuǎn)化？

l如何分離、純化干細(xì)胞？

l分化后的細(xì)胞是否有致瘤性？

l干細(xì)胞在體外發(fā)育成完整的器官尚難以做到;

l分化細(xì)胞移植仍有可能發(fā)生免疫排斥;

l倫理問(wèn)題

作業(yè)題1、什么是干細(xì)胞？如何分類(lèi)？2、干細(xì)胞有什么生物學(xué)特性？3、簡(jiǎn)述來(lái)源于ICM的胚胎干細(xì)胞分離方法。4、ESC培養(yǎng)時(shí)常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞有哪些？其作用是是什么？5、什么是成體干細(xì)胞？有哪些種類(lèi)？補(bǔ)充知識(shí)：組織工程１.組織工程的概念

應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法，研究細(xì)胞、組織誘導(dǎo)因子和生物材料間相互作用的關(guān)系，研制生物性替代物用以修復(fù)或重建組織器官的結(jié)構(gòu)，維持、恢復(fù)和改善病損組織或器官的功能。1993年Langer及Vacanti兩位學(xué)者在著名的”Science”學(xué)術(shù)期刊上提出組織工程(tissueengineering)的構(gòu)想，隨後根據(jù)此構(gòu)想將軟骨細(xì)胞培養(yǎng)於人耳形狀的生醫(yī)材料上，再植入老鼠背部(上圖)，形成具有耳朵外觀的組織，此一前瞻性技術(shù)成為組織工程研究的先驅(qū)。2.組織工程的方法活體組織細(xì)胞分離與胞外基質(zhì)分子混合細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增形成組織移植到體內(nèi)

３.組織工程的三要素

細(xì)胞、支架、信號(hào)

（1）種子細(xì)胞

細(xì)胞必須能不斷進(jìn)行細(xì)胞分裂，且必須能被調(diào)控分化成特定的組織細(xì)胞

干細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞(如MSC)組織來(lái)源細(xì)胞：自體或異體組織細(xì)胞Growthfactorstimulation

（2）組織生長(zhǎng)支架需求：

符合生物安全性要求合適的可生物降解吸收性合適的孔尺寸、高孔隙率和相連的孔形態(tài)特定的三維外形高表面積和合適的表面理化性質(zhì)與植入部位組織力學(xué)性能相匹配的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度組織工程支架的來(lái)源支架材料天然高分子材料合成降解聚合物生物陶瓷生物復(fù)合材料不同形態(tài)結(jié)構(gòu)的組織工程生物材料天然高分子材料蛋白質(zhì)支架膠原明膠多糖支架海藻酸鹽殼聚糖透明質(zhì)酸蛋白質(zhì)－多糖支架合成聚合物材料聚丙烯酸及其衍生物聚乙二醇及其共聚物聚乙烯醇聚交酯聚乳酸（PLA）聚（D,L-乳酸-co-乙醇酸）（PLGA）聚乙交酯（PGA）等支架設(shè)計(jì)及制備技術(shù)生物陶瓷磷酸鈣陶瓷聚磷酸鈣羥基磷灰石珊瑚（碳酸鈣）支架設(shè)計(jì)及制備技術(shù)成骨細(xì)