?；D移酶（AAT）活性檢測試劑盒實驗解決方案

?；D移酶（AAT）活性檢測試劑盒實驗解決方案原理AAT是一個多功能蛋白大家族，主要負責催化生物體內各種?；腿ヵ；磻诨虮磉_、代謝和信號傳導中具有重要作用。CheKine??；D移酶（AAT）活性檢測試劑盒（微量法）可檢測生物體內AAT活性，其原理是：AAT催化乙酰CoA轉移乙?；蕉〈?，同時還原DTNB生成TNB；TNB在412nm有特征吸收峰，測定412nm吸光度增加速率，來計算AAT活性。自備耗材·酶標儀或可見分光光度計（能測412nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調節(jié)式移液槍及槍頭·恒溫箱、制冰機、低溫離心機·無水乙醇·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。Receptor：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。Substrate：臨用前96T加入21.6mLReceptor，48T加入10.8mLReceptor，充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存一周，禁止反復凍融。Chromogen：臨用前96T加入無水乙醇1.2mL，48T加入無水乙醇0.6mL，充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存兩周。工作液的配制：每孔配制190μL工作液：吸取180μL溶解后的Substrate，10μLChromogen。工作液需現配現用，根據需要測定的樣本數按比例配制。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。處理好的樣本須當天檢測。1.動物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。2.植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer搗碎，冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次），然后8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。3.細胞或細菌：收集500萬細胞或細菌到離心管內，用冷PBS清洗，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次），然后8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。4.血清（漿）等液體樣本：直接測定。注意：對于脂肪含量較高的動物組織，離心后移除上層脂肪，再取上清液。如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質濃度測定。實驗步驟1.酶標儀或可見分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長到412nm，可見分光光度計用去離子水調零。2.恒溫箱預熱到37℃，工作液置于恒溫箱中預熱15min。3.在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入10μL樣本或ExtractionBuffer，190μL工作液，迅速混勻，37℃孵育2min，測定412nm處吸光值。樣本的吸光值為A測，ExtractionBuffer的吸光值為A空，計算ΔA測=A測-A空。注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA小于0.001可適當加大樣本量。如果ΔA大于1.5，樣本可用ExtractionBuffer進一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數，或減少提取用樣本量。結果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎剑ㄍ茖н^程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。A.使用96孔板測定的計算公式1.按照蛋白濃度計算活性單位定義：每mg蛋白每分鐘催化產生1nmolTNB的酶量為1個酶活單位。AAT酶活(U/mgprot)=(ΔA測÷ε÷d×V反總×109)÷(Cpr×V樣)÷T×n=1,470.6×ΔA測÷Cpr×n2.按照樣本質量計算活性單位定義：每g組織每分鐘催化產生1nmolTNB的酶量為1個酶活單位。AAT酶活(U/g鮮重)=(ΔA測÷ε÷d×V反總×109)÷(W×V樣÷V樣總)÷T×n=1,470.6×ΔA測÷W×n3.按細胞或細菌數量計算活性單位定義：每104個細胞或細菌每分鐘催化產生1nmolTNB的酶量為1個酶活單位。AAT酶活(U/104)=(ΔA測÷ε÷d×V反總×109)÷(細胞或細菌數量×V樣÷V樣總)÷T×n=1,470.6×ΔA測÷500×n=2.9412×ΔA測×n4.按液體體積計算活性單位定義：每mL樣本每分鐘催化產生1nmolTNB的酶量為1個酶活單位。AAT酶活(U/mL)=(ΔA測÷ε÷d×V反總×109)÷V樣÷T×n=1,470.6×ΔA測×nε：TNB摩爾消光系數，13.6×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應體系總體積，L，200μL=2×10-4L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；V樣：加入上清液體積，0.01mL；T：反應時間，2min；n：樣本稀釋倍數；W：樣品質量，g；V樣總：提取液體積，1mL；500：細胞或細菌總數，500萬。B.使用微量玻璃比色皿測定的計算公式將上述計算公式中的光徑d:0.5cm調整為d:1cm進行計算即可。結果展示AATAAT(U/g)Figure1.小鼠肝臟、水稻葉子和玉米種子中的AAT活性。相關產品CatalogNo.ProductNameKTB1125CheKine?丙酮酸脫羧酶（PDC）活性檢測試