第七章-代謝調(diào)節(jié)發(fā)酵的原理

代謝控制發(fā)酵技術(shù)原理與應用呂利華微生物有著一整套可塑性極強和極精確的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，以保證上千種酶能正確無誤、有條不紊地進行極其復雜的新陳代謝反應。從細胞水平上來看，微生物的代謝調(diào)節(jié)能力要超過復雜的高等動植物。這是因為，微生物細胞的體積極小，而所處的環(huán)境條件卻十分多變。代謝調(diào)節(jié)的方式：調(diào)節(jié)代謝流調(diào)節(jié)細胞膜對營養(yǎng)物質(zhì)的透性調(diào)節(jié)酶的定位以限制它與相應底物的接觸

（一）營養(yǎng)缺陷突變株的應用營養(yǎng)缺陷突變株：指原菌株發(fā)生基因突變，致使合成途徑中某一步驟發(fā)生缺陷，喪失合成某些物質(zhì)的能力，必須在培養(yǎng)中外援補充該營養(yǎng)物質(zhì)才能生長的突變型菌株。原理：由于合成途徑中某一步驟缺陷，致使終產(chǎn)物不能積累，故遺傳性地解除了終產(chǎn)物的反饋抑制，使得中間代謝物或另一分支途徑的終產(chǎn)物可以積累。反饋抑制——主要表現(xiàn)在某代謝途徑的末端產(chǎn)物過量時可反過來直接抑制該途徑中第一個酶的活性。主要表現(xiàn)在氨基酸、核苷酸合成途徑中。營養(yǎng)缺陷型突變株的工業(yè)應用

1．賴氨酸發(fā)酵

2．肌苷酸（IMP）的生產(chǎn)1．賴氨酸發(fā)酵

天冬氨酸甲硫氨酸蘇氨酸賴氨酸中間產(chǎn)物Ⅰ天冬氨酸激酶中間產(chǎn)物Ⅱ抑制高絲氨酸高絲氨酸脫氫酶人工控制黃色短桿菌的代謝過程生產(chǎn)賴氨酸天冬氨酸中間產(chǎn)物Ⅰ天冬氨酸激酶中間產(chǎn)物Ⅱ甲硫氨酸蘇氨酸高絲氨酸高絲氨酸脫氫酶不能合成可以大量積累賴氨酸人工誘變的菌種不能產(chǎn)生2．肌苷酸（IMP）的生產(chǎn)（二）抗類似物突變株的選育代謝拮抗物的作用機制：與代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似，故能夠與阻遏物及變構(gòu)酶相結(jié)合，且結(jié)合不可逆，導致有關酶不可逆地停止合成，或酶活不可逆地被抑制。方法：將誘變以后的菌懸液涂布在特定的培養(yǎng)基上（加入過量的與代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)、同時培養(yǎng)基中沒有代謝產(chǎn)物），在此平板上長出的菌落即為抗類似物突變菌株。驗證長出的突變株是否真正解除的反饋調(diào)節(jié)。幾乎所有的氨基酸和核苷可通過抗類似物突變株發(fā)酵生產(chǎn)。反饋調(diào)節(jié)作用1、終產(chǎn)物反饋阻遏和反饋抑制野生型菌株“A”氨基酸合成操縱子模型ARPOA結(jié)構(gòu)基因無活性repressorARNA聚合酶反饋阻遏活性A合成酶系（E1,E2…）A反饋抑制超過生理需要量野生型菌株酶合成水平的反饋阻遏

野生型菌株酶活性水平的反饋抑制過量A作用效應物位點，酶構(gòu)型變化，影響酶活性中心而失活Gene編碼酶效應物位點過量A酶活中心篩選突變株中常用的幾種結(jié)構(gòu)類似物積累的物質(zhì)結(jié)構(gòu)類似物

Arg刀豆氨酸

Phe對-氟苯丙氨酸、噻恩基丙氨酸

Try5-甲基色氨酸、6-甲基色氨酸

Valα-氨基丁酸鹽

IleValMetα-氨基-4-乙硫基丁酸腺嘌呤2,6-乙氨基嘌呤尿嘌呤5-氟尿嘌呤（三）營養(yǎng)缺陷型回復突變株的應用當難以找到合適類似物或者反饋調(diào)節(jié)非常復雜的時候，可采用營養(yǎng)缺陷型選育回復突變株的方法育種。原理：當一個菌株由于突變而失去某一遺傳性狀后，經(jīng)回復突變可再回復到其原有的遺傳性狀。經(jīng)過二次突變后，原發(fā)生突變的基因所編碼的酶活性中心結(jié)構(gòu)恢復，但調(diào)節(jié)中心常常會無法恢復。因此，酶既恢復了活性，且反饋抑制不再嚴重或者已經(jīng)解除。由此可以提高發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量。如金霉素生產(chǎn)菌可使用其蛋氨酸缺陷型的回復突變株，產(chǎn)量提高1.2~1.3倍。（四）控制細胞膜的滲透性

微生物的細胞膜對于細胞內(nèi)外物質(zhì)的運輸具有高度選擇性。細胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物常常以很高的濃度累積著，并自然地通過反饋阻遏限制了它們的進一步合成。采取生理學或遺傳學方法，可以改變細胞膜的透性，使細胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物迅速滲漏到細胞外。這種解除末端產(chǎn)物反饋抑制作用的菌株，可以提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。1．通過生理學手段控制細胞膜的滲透性

原理：影響細胞膜通透性的主要因素是細胞膜中的磷脂含量。故常從控制磷脂的合成或使細胞膜受損傷入手。膜合成不完全或受損，但菌體不死亡，從而積累發(fā)酵產(chǎn)物。如Glu發(fā)酵中把生物素濃度控制在亞適量，可改變細胞膜透性，從而可大量分泌Glu。生物素影響細胞膜滲透性的原因，是由于它是脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的輔基，此酶可催化乙酰CoA的羧化并生成丙二酸單酰輔酶A，進而合成細胞膜磷脂的主要成分——脂肪酸。因此，控制生物素的含量就可以改變細胞膜的成分，進而改變膜的透性和影響谷氨酸的分泌。

青霉素抑制肽聚糖中肽鏈交聯(lián)；吐溫80或陽離子表面活性劑使壁中脂類流出；產(chǎn)氨短桿菌的核苷酸發(fā)酵中控制因素是Mn2+，

Mn2+的作用與生物素相似。2．通過細胞膜缺損突變而控制其滲透性（1）谷氨酸生產(chǎn)菌的油酸缺陷型，培養(yǎng)過程中，有限制地添加油酸，合成有缺損的膜，使細胞膜發(fā)生滲漏而提高谷氨酸產(chǎn)量。原理：油酸是一種含有一個雙鍵的不飽和脂肪酸（十八碳烯酸），它是細菌細胞膜磷脂中的重要脂肪酸。油酸缺陷型突變株因其不能合成油酸而使細胞膜缺損。（2）利用石油發(fā)酵產(chǎn)生谷氨酸（解烴棒桿菌）的甘油缺陷型突變株

如：溶烷棒桿菌GL-21（甘油缺陷型）生產(chǎn)谷氨酸

PGDH

磷酸二羥丙