蛋白質(zhì)組學及其在醫(yī)學研究中的應用課件

蛋白質(zhì)組學及其在醫(yī)學研究中的應用

一、概述最早于1994年由澳大利亞一位博士后Wilkins提出,指的是“一個細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質(zhì)。”整體性、動態(tài)性和系統(tǒng)性RepresentationofaeukaryoticCell

定義：蛋白質(zhì)組學(proteomics),就是從整體的角度,分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達水平與修飾狀態(tài),了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系,揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律的一個新的研究領(lǐng)域。Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction.二、蛋白質(zhì)研究的簡要史1975年雙向凝膠電泳技術(shù)1986年第一個蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫-SWISSPROT1997年

出版了第一部蛋白質(zhì)組學的專著

2000年3月首次發(fā)表了一個生物體的完整蛋白質(zhì)組2001年6月和2001年2月公布了人類基因組框架圖和序列圖譜

三、蛋白質(zhì)組學的研究內(nèi)容組成蛋白質(zhì)組:一個細胞或組織或機體中所有蛋白質(zhì)的時空表達狀況的分析

功能蛋白質(zhì)組:蛋白質(zhì)的細胞定位、蛋白酶的活性、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的連鎖關(guān)系及其由此實現(xiàn)的信號傳遞與調(diào)控作用四、蛋白質(zhì)組研究的主要技術(shù)方法1.樣品處理方法

（1）色譜（2）亞細胞分級

（3）激光解剖單細胞水平樣品制備

（4）電荷分級與親和分級（5）變性劑及表面活性劑的作用

2.二維凝膠電泳技術(shù)(2DE)

又稱雙向電泳,是蛋白質(zhì)組學研究中的核心技術(shù)之一,是目前常用的唯一一種能夠連續(xù)地在一塊膠上分離數(shù)千種蛋白質(zhì)的方法完整的雙向凝膠電泳分析,包括樣品制備、等電聚焦、平衡轉(zhuǎn)移、SDSPAGE斑點染色、圖像捕捉和圖譜分析等步驟

Figure3.Silverstained2-Dgelsfromtissuesamplesofrabbithearts.

⑴基本技術(shù)

原理:是在相互垂直的兩個方向上,分別基于蛋白質(zhì)不同的等電點和分子量,運用等電聚焦(isoelectricfocusing,IEF)和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE),把復雜的蛋白質(zhì)混合物中的蛋白在二維平面上分離展開。第一向等電聚焦中使用IPG干膠條,將蛋白質(zhì)成分按其等電點經(jīng)分離后均勻地分布于不同的pH梯度。第一向分離后將膠條經(jīng)平衡液平衡后轉(zhuǎn)移至第二向SDSPAGE中進行。（3）檢測方法

幾個關(guān)鍵因素:靈敏度(檢測限),線性范圍,穩(wěn)定性和重復性常用的檢測方法主要有以下種：有機染料（最常用的是考馬斯亮藍）、銀染（最常用的是堿性/二氨合銀法和酸性/硝酸銀法）、負染、膠體擴散染料、有機熒光團染料、金屬螯合染料

（4）凝膠分離蛋白質(zhì)的回收

常用的方法包括:直接提取,電洗脫,電印跡至膜上,凝膠內(nèi)降解后提取的四種方法（2）2DE遇到的困難酸性和堿性蛋白質(zhì)的分析,ＭＷ較小和較大的蛋白質(zhì)的分析,低含量蛋白質(zhì)的分析,高速度自動化,變性后分離不能反映原始狀態(tài),疏水性較強的蛋白質(zhì)分析,手工操作較多、經(jīng)驗性強、可重復性差3.蛋白質(zhì)鑒定—質(zhì)譜鑒定技術(shù)

(MS)基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜(MALDIMS):利用基質(zhì)吸收激光的能量使得固相的多肽樣品離子化電噴霧電離質(zhì)譜(ESIMS):在噴射過程中利用電場完成多肽樣品的離子化通過測量肽段離子相關(guān)參數(shù),如飛行時間(ＴＯＦ),即可計算得到準確的肽段質(zhì)量通過穩(wěn)定同位素標記,還可以用質(zhì)譜進行蛋白質(zhì)的定量分析。質(zhì)譜技術(shù)還可以用于鑒定蛋白質(zhì)復合物組成、確定蛋白質(zhì)翻譯后修飾的類型與發(fā)生位點等4.蛋白質(zhì)相互作用分析—酵母雙雜交技術(shù)

分析蛋白質(zhì)之間的相互作用及其方式,認識與特定生理活動相關(guān)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò),繪制出蛋白質(zhì)相互作用的圖譜(interactionmapping),是功能蛋白質(zhì)組學的重要內(nèi)容。酵母雙雜交是一種在細胞內(nèi)檢測蛋白質(zhì)的相互作用的技術(shù),無需分離純化蛋白質(zhì),是實現(xiàn)大規(guī)模高通量分析的主要方法

原理:真核轉(zhuǎn)錄因子含有兩個相對獨立的功能域:DNA結(jié)合(DNAbindingdomain,BD)和轉(zhuǎn)錄激活(activationdomain,AD)。當兩者獨立存在時,無轉(zhuǎn)錄激活功能,但兩者只要相互接近,即可激活轉(zhuǎn)錄

存在問題：酵母雙雜交技術(shù)還存在假陽性和假陰性的發(fā)生率高的問題,而且對于不能進入核內(nèi)的蛋白質(zhì)(如分泌蛋白、膜蛋白)和存在比較復雜的翻譯后修飾作用的高等生物蛋白質(zhì),該技術(shù)尚不適用5.多維液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)

借助于同位素標記技術(shù)ICAT技術(shù)是指采用同位素標記多肽或蛋白質(zhì)的親和標簽技術(shù)(isotopecodedaffinitytags,ICAT)

可以較準確的鑒定出不同狀態(tài)細胞或組織中差異表達的蛋白質(zhì)

ICAT的原理分別用D0和D8試劑與同種細胞的不同形態(tài)（如正常細胞和病變細胞）中的蛋白質(zhì)反應，然后把兩種反應產(chǎn)物混合在一起進行酶解，用親和色譜分離被標記的肽段，進行MALDI-TOF測定，如一對峰相差8個質(zhì)量數(shù)，則為同一種蛋白質(zhì)，由D0和D8峰的相對強度進行相對定量。

存在問題：只對含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)有效,而不能測定其它的蛋白質(zhì)和多肽

6.蛋白芯片或微陣列

蛋白芯片技術(shù)的大多數(shù)是在玻璃板或膜上對蛋白或抗體進行排列缺陷：很難或不可能對翻譯后修飾進行分析，而翻譯后修飾對于大多數(shù)疾病又是很關(guān)鍵的五、蛋白質(zhì)組研究中的生物信息學生物信息學已經(jīng)成為當代生物學和醫(yī)藥學的組成部分,用于巨量生物信息資源的收集、存儲、處理、搜索、共享、服務、研究和開發(fā)。由數(shù)據(jù)庫、計算機網(wǎng)絡(luò)和應用軟件三大部分組成。1.數(shù)據(jù)庫各種不同類型的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,是蛋白質(zhì)組研究數(shù)據(jù)存儲、管理的主要形式,是實現(xiàn)已知蛋白質(zhì)的分析鑒定與未知蛋白的發(fā)現(xiàn)前提,也是總結(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與功能的規(guī)律,實現(xiàn)模擬與預測的基礎(chǔ)⑴蛋白質(zhì)氨基酸序列(sequence)數(shù)據(jù)庫

常用的有PIR、SWISSPROT、TrEMBL、GenPept等。其中PIR(proteinInformationResource)和SWISSPROT是目前最常用的兩大序列數(shù)據(jù)庫,除序列之外,還提供已知蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)域、翻譯后修飾、突變體等詳盡的注釋以及和其他重要相關(guān)數(shù)據(jù)庫的交叉檢索,是最重要的蛋白質(zhì)初級數(shù)據(jù)庫⑵蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域與家族數(shù)據(jù)庫

常用的有ProSite、BLOCKS、DOMO、ProDom、Profam等⑶蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)及分類數(shù)據(jù)庫

常用的有PDB、SWISSMODEL、NRL3D、BioMagResBank、MMDB、SCOP、CATH等。其中PDB(ProteinDataBank)最為著名,收錄有蛋白質(zhì)原子座標、晶體結(jié)構(gòu)和核磁共振的數(shù)據(jù)、一級和二級結(jié)構(gòu)信息及相關(guān)文獻引用⑷蛋白質(zhì)2DE圖譜數(shù)據(jù)庫

包括SWEISSPROT2DEPAGE、SEINA2DEPAGE等綜合性2DE數(shù)據(jù)庫和不同生物、不同器官、組織、細胞的專一性2DE數(shù)據(jù)庫⑸蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫

常用的有ProNet、DIP、INTERACT等。除以上數(shù)據(jù)庫之外,還有各種類型的專一性蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。上述數(shù)據(jù)庫資源,均可通過訪問ExPASy(ExpertProteinAnalysisSystem),北京大學鏡像

獲得鏈接2.工具軟件

⑴蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜分析軟件:比較知名的2DE圖像分析軟件有GenevaBioinformatics提供的Melanie4、美國ProteomeWorks公司的商用軟件包PDQuest6.1、英國公司NonlinearDynamicsLtd.的Progenesis、德國DecodonGmbH的Delta2D等應用此類軟件可完成電泳圖譜背景消減與條紋消除、斑點探測、圖形匹配和定量測定、數(shù)據(jù)存儲與分析等一系列工作。個別功能強大的軟件還具有數(shù)據(jù)統(tǒng)計、不同凝膠的比較、數(shù)據(jù)庫聯(lián)接檢索、斑點注釋等特殊功能⑵蛋白質(zhì)鑒定工具

蛋白質(zhì)的鑒定,需要利用實驗得到的相關(guān)數(shù)據(jù),通過相關(guān)的算法與程序,進行已知蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的搜索比對來完成。目前已有的鑒定工具,根據(jù)使用者提交的信息類型可以分為氨基酸組成比對、肽片段質(zhì)量比對和部分肽段序列比對三類。常用的有AACompIdent、PeptIdent、ＳEQUEST、MultiIdent等⑶蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析與功能預測工具

常見的有蛋白質(zhì)翻譯后修飾的預測、蛋白質(zhì)序列分析與二級結(jié)構(gòu)預測、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預測、功能域、蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預測等各種用途的工具軟件。這些工具的應用可以對蛋白質(zhì)相關(guān)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與功能的實驗研究,起到一定的指導參考作用六、蛋白質(zhì)組在醫(yī)學研究中的應用

1.疾病的蛋白質(zhì)組研究

通過測定體液和組織的蛋白質(zhì)組,我們可以尋找特異疾病的生物標記,即疾病特異性蛋白(diseasespecificproteins,DSPs)。DSPs水平的變化對于疾病診斷、治療和判斷愈后具有重要意義,還可以成為研究藥物的藥理或毒理作用的靶點。⑴腫瘤研究領(lǐng)域

應用DNA芯片技術(shù)實現(xiàn)了通過全基因組分析檢測癌變過程中基因異?；罨蚋淖?但一些與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的改變可能與基因水平異常無關(guān)通過比較對腫瘤細胞和正常細胞的蛋白質(zhì)表達情況,可以鑒定出腫瘤特異性標記或特異性抗原,為診斷與治療提供線索。

泌尿系統(tǒng)腫瘤對膀胱腫瘤細胞和尿道蛋白的大規(guī)模2D后建立了膀胱惡性腫瘤數(shù)據(jù)庫,包括移行細胞癌和鱗狀細胞癌的表達譜;進一步建立了膀胱癌患者尿液中分泌性蛋白的數(shù)據(jù)庫

其它惡性腫瘤肝癌乳腺癌原發(fā)性肺腺癌卵巢癌白血?、菩难芗膊⊙芯款I(lǐng)域

目前,已經(jīng)建立了人和大鼠、狗等實驗動物的心房、心室與內(nèi)皮細胞的蛋白質(zhì)2DE圖譜的一系列數(shù)據(jù)庫(http://www.expasy.ch/ch2d/2dindex.html),鑒定了數(shù)百個心血管系統(tǒng)特有的蛋白質(zhì)。對擴張型心肌病(DCM)的系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組研究：發(fā)現(xiàn)了大約100個表達異常的蛋白質(zhì),并進行了分類。他們還將2DE與免疫標記相結(jié)合,鑒定了一些能和自身抗體發(fā)生反應的心臟特異性抗原。這些抗原與心臟移植中的急性或慢性排斥反應有關(guān)

缺血性心臟病SchwertzH等應用二維凝膠及電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)研究了家兔心肌缺血再灌注（I/R）以后蛋白的表達變化，并使用一種人工絲氨酸蛋白酶抑制劑FUT-175進行干預，研究了該物質(zhì)對I/R損傷的保護作用。⑶神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病研究領(lǐng)域

對精神分裂癥患者以及正常人群的腦脊液進行蛋白質(zhì)組學的研究。對老年癡呆癥(Ａlzhermer癥)的研究：通過對神經(jīng)原纏結(jié)的2ＤＥ及質(zhì)譜分析則發(fā)現(xiàn),其主要蛋白質(zhì)成份-微管相關(guān)蛋白τ(ＭＡＰτ)在疾病狀態(tài)下發(fā)生了磷酸化、糖基化等多種修飾作用。2.病原微生物的蛋白質(zhì)組研究

⑴確定致病菌毒力;⑵尋找新的診斷標記物;⑶為疫苗的研制尋找新的候選抗原;⑷闡明藥物抗菌作用機制與病菌耐藥性發(fā)生機理,為新的抗生素的研制尋找靶點

3.蛋白質(zhì)組在藥物開發(fā)中的應用

疾病特異性蛋白的不斷發(fā)現(xiàn)為藥物設(shè)計提供了豐富的靶點,另外通過翻譯后修飾的蛋白質(zhì)組學研究,使得新藥研制獲得了前所未有的契機。以ＤＳＰｓ為靶點,分析其分子結(jié)構(gòu),定向合成有效藥物成為藥物設(shè)計的理想模式。⑴藥物靶點的發(fā)現(xiàn)

在病理狀態(tài)下表達異?；蛘咛禺愋员磉_的蛋白質(zhì),以及細胞信號傳遞通路中的關(guān)鍵性蛋白,都可能作為藥物設(shè)計與發(fā)現(xiàn)的靶分子。病原微生物蛋白質(zhì)組研究,也有助于了解其致病的機理和發(fā)現(xiàn)對藥物敏感的蛋白質(zhì),為新的抗生素篩選提供更合理的靶點。⑵靶點的評價、認定與篩選的優(yōu)化

通過對已知藥物治療前后病理組織的蛋白質(zhì)組進行比較分析,不僅可以加快藥物靶點的認定,減少后續(xù)工作的盲目性,還有助于闡明藥物的分子藥理,構(gòu)建更為合理的篩選模型。將蛋白質(zhì)組分析與組合化學的方法相結(jié)合,對結(jié)構(gòu)類似物的構(gòu)效關(guān)系作出比較,加速先導化合物的篩選與優(yōu)化。⑶藥物毒理學分析與臨床前安全性評價

通過發(fā)生損傷的組織器官與正常組織器官之間的蛋白質(zhì)組比較,有助于闡明藥物毒副作用的發(fā)生機制。進行已知藥物的毒理學蛋白質(zhì)組分析,可以鑒定和積累特定組