SYBRGreenI熒光定量PCR教案

會計學1SYBRGreenI熒光定量PCR主要內容第一部分：PCR簡介第二部分：RNA的提取第三部分：RT第四部分：實時熒光定量PCR第五部分：數據分析第六部分：誤差校正第七部分：常見問題分析第1頁/共65頁第一部分：PCR簡介第2頁/共65頁PCR技術的發(fā)明v1985年教授發(fā)明了具有劃時代意義的PCR技術。第3頁/共65頁PCR

PolymeraseChainReaction

vPCR(聚合酶鏈式反應)技術是一種體外快速擴增特定DNA片段的方法。

v

是一個在引物介導下反復進行熱變性、退火、引物延伸三個步驟而擴增DNA的循環(huán)過程。

v運用PCR技術能快速特異地擴增所希望的目的DNA片段，使皮克(Pg，10－12）起始物達到微克（μg，10－6）水平。第4頁/共65頁2.PCR原理第5頁/共65頁PCR類型RT-PCR兼并引物PCR巢式PCR反向PCR不對稱PCR原位PCR重組PCR熒光定量PCR

錨定PCR多重PCR定量PCR

……第6頁/共65頁實時熒光定量PCR技術

real-timefluorescentquantitativePCR

FQ-PCR是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過特定數學原理對未知模板進行定量分析的方法，實現了PCR從定性到定量的飛躍。第7頁/共65頁實時熒光定量PCR技術分類熒光探針

Beacon法：以美國人Tagyi為代表

TaqMan探針:以美國ABI公司為代表

FRET技術:以羅氏公司為代表熒光染料飽和熒光染料:EvaGreen、LCGreen

非飽和熒光染料:SYBRGreenⅠ第8頁/共65頁第9頁/共65頁第10頁/共65頁第二部分：RNA的提取第11頁/共65頁提RNA基本步驟標本Trizol異丙醇75%乙醇DEPC水溶解氯仿第12頁/共65頁RNA的抽提注意事項所有用具去RNase處理戴口罩、帽子，勤換手套，防外源RNase污染盡量快速4℃離心：室溫會導致不適當分層，從而導致變異RNA產物。第13頁/共65頁一、標本的處理新鮮、低溫保存、避免反復凍融。易至RNA降解，提取量下降。二、勻漿：Trizol

裂解細胞，使核蛋白體解離，釋放RNA；抑制RNase活性；酸性酚使RNA進入水相。過多：上清液變?yōu)榧t色，浪費。過少：未加氯仿前即分層。裂解不充分，

RNase抑制不充分，得率低，RNA完整性、純度受損。三、抽提、分層：氯仿變性蛋白，抽提去除過多的酚，加速有機相與水相的分層。過少：上述作用減弱，影響RNA質量。過多：使DNA和蛋白進入水相，影響RNA質量。四、沉淀：異丙醇過多：會沉淀鹽和其他污染物，使用乙醇不能洗脫。五、洗滌：75%乙醇去鹽作用，根據情況可重復幾次。六、溶解：DEPC水掌握溶解時間。太早：沉淀物太濕，含有乙醇會影響后續(xù)反應。太遲：沉淀物太干，不易溶解。

RNA的抽提注意事項第14頁/共65頁標本Trizol異丙醇75%乙醇DEPC水溶解氯仿4℃：過夜-70℃：一個月4℃：過夜-20℃：時間長會使鹽沉淀4℃：1周-20℃：1年

-70℃：1年以上第15頁/共65頁RNA得率檢測——分光光度計

260nm:核酸

280nm:蛋白等有機體

230nm:雜質濃度

320nm:溶液渾濁度總RNA濃度（ng/μl）=OD260×40×稀釋倍數（ng/μl）

OD260讀數介于0.1～1.0之間可靠（20～3200ng/μl）RNA的質量第16頁/共65頁RNA的質量第17頁/共65頁RNA完整性鑒定第18頁/共65頁第三部分：RT第19頁/共65頁RT反應體系RNA1μgPrimer

1μL5×ReactionBuffer4μLRNaseinhibitor（20U/μL）1μL10mMdNTPmix2μLReverseTranscriptase（200U/μL)1μLDEPC-treatedwaterupto20μL第20頁/共65頁RT引物的選擇是一系列寡核苷酸片段的混合物，它含有各種可能的核苷酸排列順序，因此可與任意核酸序列雜交。第21頁/共65頁RT反應條件25℃,5min；(隨機引物加此步)42℃,60min；70℃,5min。第22頁/共65頁RT反應的注意事項冰上操作配制混合液試劑短暫離心移液槍：用完之后要歸到最大計量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性。第23頁/共65頁第四部分：實時熒光定量PCR第24頁/共65頁SY法-PCR反應基本組分vDNAPolymeraseDNA聚合酶vdNTP四種脫氧核苷酸Buffer緩沖溶液rox內參染料SYBRGreenⅠ熒光染料vPrimerF/R引物（上游/下游）vTemplate模板Mix第25頁/共65頁PCR實驗操作注意事項v冰上操作v配制混合液v試劑短暫離心v防止污染：分區(qū)操作v移液槍：用完之后要歸到最大計量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性。第26頁/共65頁PCR反應條件95℃，10min；95℃，15sec，60℃，30sec，72℃，30sec，反應結束后，立即進行溶解曲線分析。

95℃，15sec，

60℃，60sec，

95℃，15sec，

60℃，15sec。for40cycles第27頁/共65頁第28頁/共65頁第五部分：數據分析第29頁/共65頁結果：

擴增曲線熔解曲線標本陰性陰性標本第30頁/共65頁理論擴增曲線實際擴增曲線PCR擴增曲線Rn（Normalizedreporter）：是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值?！鱎n：△Rn是Rn扣除基線后得到的標準化結果（△Rn=Rn-基線）。第31頁/共65頁第32頁/共65頁第33頁/共65頁第34頁/共65頁第35頁/共65頁第36頁/共65頁Tm值：雙鏈DNA解鏈50%的溫度。第37頁/共65頁第38頁/共65頁第39頁/共65頁數據分析：相對定量：不用得到絕對的拷貝數，只需計算表達差異即可，得到的結果是某基因表達水平升高了或降低了多少倍。2-△△CT

表示實驗組目的基因表達相對于對照組變化的倍數。

ΔCt=Ct目的-Ct內參

ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt

對照組第40頁/共65頁第六部分：誤差校正第41頁/共65頁模板方面的誤差：IPC校正取樣量即細胞數量、抽提效率、純化損失、反轉錄效率等操作誤差：ROX校正試劑取用誤差的主要部分、受耗材質量及儀器等影響而產生的熒光激發(fā)波動其余誤差：統計校正重復實驗，取平均值第42頁/共65頁第43頁/共65頁第44頁/共65頁第45頁/共65頁第46頁/共65頁總結設計合格的引物。適當濃度的模板。設定內參和陰性對照。使用合適的ROX。實驗時做復孔。冰上操作。第47頁/共65頁第七部分：常見問題分析第48頁/共65頁問題1：無Ct值出現檢測熒光信號的步驟有誤:一般SG法采用72℃延伸時采集。引物或探針降解:可通過PAGE電泳檢測其完整性。模板量不足:對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

模板降解:避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。第49頁/共65頁問題2：Ct值出現過晚

擴增效率低:反應條件不夠優(yōu)化。設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。PCR

產物太長:一般采用80-150bp的產物長度。PCR

各種反應成分的降解或加樣量的不足。模板量低。第50頁/共65頁問題3：陰性對照有信號Mix或水被污染。如使用ROX校正，則可能為ROX降解所致。引物二聚體的出現：35循環(huán)后出現屬正常，配合熔解曲線進行分析提高退火溫度；降低引物濃度；冰上操作；重新設計引物

第51頁/共65頁問題4：溶解曲線不止一個主峰引物設計不夠優(yōu)化：應避免引物二聚體和發(fā)夾結構的出現。

引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。cDNA為1：5引物終濃100nmcDNA為1：5引物終濃50nm第52頁/共65頁問題5：重復性差

1.加樣不準確。

2.儀器在樣品上溫度條件有差異，即溫度均一性不好。

3.模板濃度低。樣品初始濃度越低，重復性越差，應減少樣品的稀釋倍數。第53頁/共65頁問題6：熔解曲線只有上升支

擴增產物的Tm值較高，設置熔解曲線時改95度為99度。第54頁/共65頁99.0第55頁/共65頁問題7：擴增曲線異常

基線設置有誤。高濃度的模板會導致CT值過早出現，即基線范圍變小，導致機器讀取熒光數值有誤。第56頁/共65頁問題8：擴增熔解曲線不同，ct值卻相同模板起始濃度相同，擴增效率不同。第57頁/共65頁問題9：ct值不同，熔解曲線同，擴

增曲線還高模板起始濃度不相同，擴增效率基本相同。第58頁/共65頁第59頁/共65頁問題10：預實驗時為單峰，正式時為雜峰。cDNA為1：5引物終濃度50nmcDNA為1：10引物終濃度50nmcDNA為1：5引物終濃度100nmcDNA為1：5引物終濃度100nm引物有問題：使用另一對引物則為特異性擴增。第60頁/共65頁問題11：模板降低時