生藥活性成分的高通量篩選技術(shù)

生藥活性成分的高通量篩選技術(shù)高通量篩選(Highthroughputscreening，HTS)技術(shù)是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來的一種藥物篩選新技術(shù)。它集計(jì)算機(jī)控制、自動(dòng)化操作、高靈敏度檢測(cè)、數(shù)據(jù)結(jié)果自動(dòng)采集和處理于一體，實(shí)現(xiàn)了藥物篩選的快速、微量、靈敏和大規(guī)律，日篩選量達(dá)到數(shù)萬甚至數(shù)十萬樣品次，是新藥發(fā)現(xiàn)技術(shù)和方法的一大進(jìn)步。

傳統(tǒng)的藥物篩選方法是采用藥理學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法，通過體內(nèi)、體外的多種實(shí)驗(yàn)方法，評(píng)價(jià)藥用樣品的藥理活性。但是，由于傳統(tǒng)的藥理實(shí)驗(yàn)方法需要消耗大量樣品，使用大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，參加實(shí)驗(yàn)的技術(shù)人員具有較熟練的操作技能，而且篩選樣品量有限，勞動(dòng)強(qiáng)度大，不能適應(yīng)大量樣品的同時(shí)篩選。高通量藥物篩選是在傳統(tǒng)的篩選技術(shù)基礎(chǔ)上，應(yīng)用先進(jìn)的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、計(jì)算機(jī)、自動(dòng)化控制等高新技術(shù)，建立的一套更適合于藥物篩選的技術(shù)體系。

本文試對(duì)高通量篩選技術(shù)的基本原理及其在生藥活性成分篩選中的應(yīng)用做一簡(jiǎn)單論述。

1．基本原理

高通量藥物篩選技術(shù)是將多種技術(shù)方法有機(jī)結(jié)合而形成的新的技術(shù)體系，它以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過程，以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。它的正常開展需要有一個(gè)高容量的化合物庫、自動(dòng)化的操作系統(tǒng)、高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)、高效率的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)以及高特異性的藥物篩選模型。

1.1化合物樣品庫

高通量篩選是一種利用已有的化合物進(jìn)行的體外隨機(jī)篩選。因此通過高通量藥物篩選發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物(leadingcompounds)的有效性取決于化合物樣品庫中化合物的數(shù)量及其質(zhì)量?；衔飿悠返臄?shù)量是指不同樣品的數(shù)量?；衔飿悠返馁|(zhì)量主要由化合物結(jié)構(gòu)的多樣性決定的。許多活性反應(yīng)基團(tuán)(reactivegroups)使初篩的假陽性大量增加，剔除這些化合物可以提高化合物樣品庫的質(zhì)量。

化合物樣品主要有人工合成和從天然產(chǎn)物中分離純化兩個(gè)來源。

人工合成又可分為常規(guī)化學(xué)合成和組合化學(xué)合成兩種方法。采用常規(guī)化學(xué)合成的純化合物一直是國(guó)外制藥企業(yè)建立化合物樣品庫的主要來源。它們通過長(zhǎng)年積累的化合物建立化合物樣品庫，通過購買和化合物交流使化合物樣品庫的數(shù)量和質(zhì)量大幅度提高。

組合化學(xué)(combinatorialchemistry)的出現(xiàn)為大量增加化合物的數(shù)量提供另外一種來源。組合化學(xué)的基本原理是采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法，在特定的分子母核上加入不同的基團(tuán)，在同樣條件下，產(chǎn)生大量的新化合物。這種方法在化合物的結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化方面已經(jīng)表現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。但是，由于該方法是基于母核結(jié)構(gòu)的改造，因此產(chǎn)生的大量化合物在結(jié)構(gòu)多樣性方面尚有極大的不足。解決組合化學(xué)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性的問題，已經(jīng)成為化學(xué)研究人員的研究課題。

從天然產(chǎn)物中分離出來的化合物，母核結(jié)構(gòu)和活性基團(tuán)是長(zhǎng)期的自然選擇形成的，它們通過高通量篩選所表現(xiàn)出來的生物活性在藥物發(fā)現(xiàn)中具有人工合成化合物所不能比擬的優(yōu)勢(shì)。因此，增加樣品庫中具結(jié)構(gòu)多樣性的天然化合物及其衍生物是提高樣品庫質(zhì)量的一個(gè)重要途徑?？鐕?guó)制藥企業(yè)為了增加高通量篩選的陽性率，已經(jīng)或正在尋求助買我國(guó)的天然產(chǎn)物單體。

1.2自動(dòng)操作系統(tǒng)

高通量藥物篩選每天要對(duì)數(shù)千化臺(tái)物樣品進(jìn)行檢測(cè)，工作枯燥、步驟單一，人工操作容易疲勞、出錯(cuò)。自動(dòng)化操作系統(tǒng)采用微孔板作為反應(yīng)容器，具有固定的分布模式(format)；不同的微孔板通過條形碼加以標(biāo)記。自動(dòng)化操作系統(tǒng)通過光電閱讀器對(duì)特定的微孔板上的特定位置進(jìn)行操作，并將操作結(jié)果及相關(guān)數(shù)據(jù)存貯在計(jì)算機(jī)內(nèi)，使篩選結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)過程快速。

自動(dòng)化操作系統(tǒng)利用計(jì)算機(jī)通過操作軟件控制整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。操作軟件采用實(shí)物圖像代表實(shí)驗(yàn)用具，簡(jiǎn)潔明了的圖示代表機(jī)器的動(dòng)作。編程過程簡(jiǎn)潔明了，可操作性強(qiáng)。自動(dòng)化操作系統(tǒng)的工作能力取決于系統(tǒng)的組成都分，根據(jù)需要可配置加樣、沖洗、溫解、離心等設(shè)備以進(jìn)行相應(yīng)的工作。

除了實(shí)驗(yàn)步驟的需要以外，自動(dòng)化的加樣方式是決定篩選速度的重要因素。目前主要有單孔、8孔、96孔、384孔等幾種方式。單孔一般用于對(duì)照樣品以及復(fù)篩中零散樣品的轉(zhuǎn)移。96孔、384孔在酶活性檢測(cè)以及需同時(shí)開始、同時(shí)終止反應(yīng)的篩選模型中是必需的。

自動(dòng)化操作系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分是堆棧(hotel)。所謂堆棧是指在操作過程中用來放置樣品板、反應(yīng)板以及對(duì)它們進(jìn)行轉(zhuǎn)移所需的騰挪空間。因此，高通量篩選的樣品數(shù)量取決于堆棧的容量。

由此可見，高通量藥物篩選的自動(dòng)化操作系統(tǒng)由計(jì)算機(jī)及其操作軟件、自動(dòng)化加樣設(shè)備、溫孵離心等設(shè)備、堆棧4個(gè)部分組成。不同的單位可根據(jù)主要篩選模型類型、篩選規(guī)模選購不同的部分整合成為一個(gè)完整的操作系統(tǒng)。

1.3檢測(cè)系統(tǒng)

快速、高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)是高通量藥物篩選的關(guān)鍵技術(shù)之一。在高通量藥物篩選中，檢測(cè)系統(tǒng)一般采用液閃計(jì)數(shù)器、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)計(jì)數(shù)器、寬譜帶分光光度儀、熒光光度儀等。檢測(cè)儀器靈敏度的不斷提高，即使對(duì)微量樣品的檢測(cè)，也可以得到很好的檢測(cè)效果。

1.3.1液閃計(jì)數(shù)放射性同位素廣泛用于受體結(jié)合測(cè)定、細(xì)胞毒性、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、藥物代謝示蹤以及基因分析中。由于采用了雙光電倍增管及時(shí)間分辨偶合回路(time-resolvedcoincidencecircuit)技術(shù)，有效地降低了背景信號(hào)的干擾，使測(cè)定靈敏度提高，同位素用量少。在96孔板的分析檢測(cè)中，背景信號(hào)可控制在10cpm左右。

親和閃爍分析(scintil1ationproximityassay，SPA)是一種新的液閃分析法。該方法在細(xì)胞表面受體藥物篩選中應(yīng)用較為普遍。在高通量篩選測(cè)定細(xì)胞表面受體親合結(jié)合作用時(shí)，放射配體標(biāo)記濾過分析技術(shù)由于需要進(jìn)行分離，現(xiàn)已被親合閃爍分析所取代。親合閃爍分析技術(shù)通過親合結(jié)合，將放射性配基結(jié)合到具有受體的閃爍球上，從而產(chǎn)生光子，減少了放射配體標(biāo)記分析中的游離配基與結(jié)合配基的分離過程，使得放射配基分析可完全以自動(dòng)化的方式進(jìn)行，適于進(jìn)行高通量篩選。產(chǎn)生低能量放射粒子的同位素可被用來進(jìn)行放射性標(biāo)記，而這種低能量放射粒子在短距離內(nèi)可被重吸收，以確保只有結(jié)合到受體表面的配基才被檢測(cè)到。SPA技術(shù)被廣泛的應(yīng)用到激酶、核酸處理酶分析以及受體配體的相互作用分析中。

1.3.2分光光度法為了適應(yīng)高通量藥物篩選，許多公司都生產(chǎn)了具備計(jì)算機(jī)接口并能對(duì)多孔板進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的分光光度計(jì)。以MolecularDevice公司的spectra190為例，它采用8條光導(dǎo)纖維同時(shí)對(duì)8孔進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定波長(zhǎng)以2nm為間隔，可以在190nm一850nm間進(jìn)行選擇。對(duì)未知物質(zhì)，可在該范圍內(nèi)進(jìn)行掃描以確定其特征吸收光譜。因此，大大增加了建立模型的多樣性。檢測(cè)數(shù)據(jù)以不同文件格式輸出，可用隨機(jī)軟件或通用數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行處理。方便、快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高。分光光度法高靈敏儀器同自動(dòng)化操作系統(tǒng)的連接，使得基于紫外、可見光譜的高通量藥物篩選模型成為主要模型種類。

1.3.3化學(xué)發(fā)光檢測(cè)化學(xué)發(fā)光指生色物質(zhì)在酶促作用下，化學(xué)能以光子的形式釋放出來。化學(xué)發(fā)光根據(jù)發(fā)光的形式和種類分為輝光型和閃光型發(fā)光兩種。輝光型化學(xué)發(fā)光如以AMPPD、CDPS、ECL、Diagoxigein等為基礎(chǔ)的發(fā)光反應(yīng)。其發(fā)光時(shí)間較長(zhǎng)且穩(wěn)定。而以發(fā)光蛋白、ATP、熒光素酶等為底物的發(fā)光反應(yīng)則是閃光型發(fā)光反應(yīng)，其發(fā)光時(shí)間較短。由于時(shí)間分辨及偶合回路技術(shù)的使用，對(duì)于背景的去除更為有效，使得化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.1pg數(shù)量級(jí)。在單孔Erusalimsky等建立了新型細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)物的高通量篩選方法。細(xì)胞預(yù)先用3Ｈ胸苷標(biāo)記，與凋亡誘導(dǎo)物孵育后，連續(xù)經(jīng)過兩種玻璃濾器。一個(gè)是中性的，捕獲完整的染色質(zhì)和高分子量ＤＮＡ。另一個(gè)裝有DEAE活性基團(tuán)，捕獲低分子量DNA碎片。通過對(duì)濾器上放射性的測(cè)量，可以對(duì)DNA的破碎情況定量。

1.5.5.3抗腫瘤活性Lu等建立了用高通量“生物活性指紋”篩選抗肺癌藥物的方法，考察受試分子(類維生素Ａ及類維生素Ａ相關(guān)分子)對(duì)許多不同細(xì)胞系的效應(yīng)特點(diǎn)。檢測(cè)指標(biāo)包括：(1)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè)。選擇了約50種腫瘤和非腫瘤細(xì)胞，包括了大量不同的組織和(或)腫瘤來源。細(xì)胞暴露于受試化合物5ｄ后，用標(biāo)準(zhǔn)比色法測(cè)定存活細(xì)胞百分率。20%生長(zhǎng)抑制率指示有活性。(2)集落形成抑制檢測(cè)，用以區(qū)分細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用和細(xì)胞殺傷作用。6孔板上加NCI-H292非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，暴露于受試物一定時(shí)間。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗，植于無受試物的培養(yǎng)介質(zhì)共7d。用結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞染色，考察集落形成情況。(3)凋亡檢測(cè)，用ELISA方法測(cè)量細(xì)胞DNA破碎。(4)轉(zhuǎn)錄調(diào)控檢測(cè)，用以考察受試化合物是否有類維生素Ａ受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制作用。方法是將HeLaTK-細(xì)胞用73Col-CAT報(bào)告基因連同受體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，與受試物一起培養(yǎng)，用ELISA方法檢測(cè)CAT活性。

1.5.5.4G2Roberge等建立了G2期檢查點(diǎn)抑制劑的高通量篩選方法。將MCF-7mp53細(xì)胞培養(yǎng)，種在96孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)板上。照射使細(xì)胞進(jìn)入G2靜止期，加入受試化合物用ELISA方法檢測(cè)核仁蛋白(nucleolin)的磷酸化形式，從而得到從G2期釋放進(jìn)入Ｍ期的細(xì)胞數(shù)量，即抑制G2檢查點(diǎn)程度。

1.5.5.5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Su等建立了TGFβ3通路作用物的高通量篩選方法。構(gòu)建融合報(bào)告基因，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，選擇蟲熒光素酶表達(dá)能被TGFβ高誘導(dǎo)的克隆。將細(xì)胞植于96孔板，與受試化合物孵育后，稀釋并加入Steady-Glo底物測(cè)蟲熒光素酶活力，與對(duì)照比較，計(jì)算相對(duì)酶活性增加值。

1.5.5.6細(xì)菌蛋白分泌Alksne等建立了以抑制細(xì)菌蛋白分泌為作用方式的新型抗生素的高通量篩選方法。該方法基于SecA-lacZ融合報(bào)告基因。SecA是一種自我調(diào)控翻譯的蛋白，當(dāng)細(xì)菌蛋白分泌被干擾時(shí)，該報(bào)告基因被誘導(dǎo)。

1.5.5.7細(xì)菌生長(zhǎng)Chung等建立了抑制分枝桿菌生長(zhǎng)化合物的高通量篩選方法。選擇了一種腐生性分枝桿菌代替結(jié)核分枝桿菌，因其具有生長(zhǎng)迅速以及非感染性的特點(diǎn)。通過測(cè)定細(xì)胞攝入放射性標(biāo)記的尿嘧啶，考察受試化合物對(duì)分枝桿菌活力的作用。用96孔板的形式，1d內(nèi)可以測(cè)試數(shù)千個(gè)樣品。

2．生藥活性成分的高通量篩選

樣品是高通量藥物篩選的物質(zhì)基礎(chǔ)，樣品庫來源的化學(xué)多樣性是決定高通量篩選技術(shù)能否成功的關(guān)鍵因素之一。前面我們談到，化合物樣品主要有常規(guī)化學(xué)合成、組合化學(xué)合成和從天然產(chǎn)物中分離純化幾個(gè)來源。而從天然產(chǎn)物中分離出來的化合物，由于其母核結(jié)構(gòu)和活性基團(tuán)是長(zhǎng)期的自然選擇形成的，它們通過高通量篩選所表現(xiàn)出來的生物活性在藥物發(fā)現(xiàn)中具有人工合成化合物所不能比擬的優(yōu)勢(shì)。

我國(guó)擁有非常豐富的藥材資源，幾十年來，我們應(yīng)用藥理學(xué)手段，對(duì)我國(guó)的傳統(tǒng)藥物進(jìn)行了大規(guī)模的研究和篩選，取得了巨大成就。但是，僅僅依靠傳統(tǒng)的藥理實(shí)驗(yàn)方法，既耗時(shí)，勞動(dòng)強(qiáng)度又大，還需要使用大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，顯然不能適應(yīng)大量樣品的同時(shí)篩選。雖然經(jīng)過努力，已從生藥中分離、提取、純化出大量化合物，但由于研究手段的落后，使大量分離出的化合物得不到充分的利用，造成了化合物資源的極大浪費(fèi)。

因此，將高通量篩選技術(shù)應(yīng)用于生藥的活性成分研究，既是對(duì)高通量篩選技術(shù)的不斷完善，又是將這一技術(shù)應(yīng)用于中藥現(xiàn)代化研究的有益嘗試。

如何對(duì)生藥的活性成分進(jìn)行高通量篩選呢？其原理、方法和人工合成化合物的高通量篩選基本一致，區(qū)別主要在于篩選前需要從生藥中將化合物提取出來并進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆蛛x和化學(xué)多樣性的評(píng)價(jià)。相同的就不再贅述，這里主要談一下提取、分離和多樣性評(píng)價(jià)的問題。

2.1提取由于高通量篩選需要大量的樣品來源，所以常規(guī)的提取方法顯然不能滿足這一要求。尋找一個(gè)快速、高效、連續(xù)、自動(dòng)化的提取方法顯得迫在眉睫。加速溶劑提取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一個(gè)新的提取技術(shù)，在準(zhǔn)備好樣品和對(duì)提取方法（或程序）進(jìn)行設(shè)定后，自動(dòng)進(jìn)樣和自動(dòng)收集裝置就可以連續(xù)對(duì)最多24個(gè)不同樣品自動(dòng)完成樣品的提取和提取液的收集，簡(jiǎn)單方便。應(yīng)用這一技術(shù)，可以得到大量的生藥的提取物。

2.2分離及化學(xué)多樣性評(píng)價(jià)我們都知道，生藥的化學(xué)成分相當(dāng)復(fù)雜，通過提取得到的提取物往往是大量單體組成的混合物，所以篩選前需要對(duì)生藥的提取物進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆蛛x。在眾多的分離手段中，制備型HPLC應(yīng)該是最為理想的，它具有快速、高效、自動(dòng)化等諸多優(yōu)點(diǎn)。

分離完成后還需要對(duì)分離的物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)多樣性的評(píng)價(jià)，以提高高通量篩選的效率。以前，這種評(píng)價(jià)多是基于物種的地理分布、生物學(xué)分類、化學(xué)分類以及基源等關(guān)系，近年來，隨著科技的進(jìn)步，多種現(xiàn)代化手段開始應(yīng)用于化學(xué)多樣性的評(píng)價(jià)。其中，色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-ESI-MS）技術(shù)在這方面做出了有力的嘗試。首先，它做出成分的離子信號(hào)（m/z）對(duì)保留時(shí)間的平面圖，然后對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的相似度評(píng)估從而對(duì)樣品的多樣性進(jìn)行定量的評(píng)價(jià)。接著，三維的HPLC數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)換為CDF文件格式并傳輸?shù)経NIX工作站。數(shù)據(jù)文件中的每一個(gè)離子（包括保留時(shí)間、質(zhì)量、離子強(qiáng)度等數(shù)據(jù)）被定位在一個(gè)二維圖譜中，保留時(shí)間和質(zhì)量分占一個(gè)軸，離子強(qiáng)度數(shù)據(jù)儲(chǔ)存在位點(diǎn)中。濾除噪聲以后，離