DB32T 5062-2025人類腸道菌群樣本制備和保藏技術(shù)規(guī)范

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T5062—2025人類腸道菌群樣本制備和保藏技術(shù)規(guī)范Technicalspecificationforhumanintestinalflorasamplepreparationandpreservation2025-02-21發(fā)布2025-03-21實(shí)施江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社發(fā)布出版Ⅰ前言 Ⅲ 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4基本要求 5.1方案制定 5.2知情同意 5.3糞便樣本 5.4腸道菌群樣本 7數(shù)據(jù)管理 附錄A（資料性）布里斯托大便分類法 附錄B（資料性）數(shù)據(jù)記錄明細(xì) 參考文獻(xiàn) Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省衛(wèi)生健康委員會(huì)提出并組織實(shí)施。本文件由江蘇省衛(wèi)生健康標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：蘇州市疾病預(yù)防控制中心、南京醫(yī)科大學(xué)、徐州市賈汪區(qū)疾病預(yù)防控制中心、蘇州善佰生物技術(shù)有限公司。DB32/T5062—20251人類腸道菌群樣本制備和保藏技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了人類腸道菌群樣本制備和保藏的基本要求、制備流程、保藏要求和數(shù)據(jù)管理等技術(shù)本文件適用于人類腸道菌群樣本制備和保藏。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T37864生物樣本庫質(zhì)量和能力通用要求GB/T39725信息安全技術(shù)健康醫(yī)療數(shù)據(jù)安全指南GB/T41908人類糞便樣本采集與處理GB/T41910洗滌糞菌質(zhì)量控制和糞菌樣本分級(jí)WS233病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。腸道菌群intestinalflora寄居在腸道內(nèi)的正常菌群、條件致病菌和致病菌等微生物群系。生物樣本庫biobank開展生物樣本獲得和儲(chǔ)存過程的合法實(shí)體或其部分，獲得和儲(chǔ)存過程包括生物樣本及相關(guān)數(shù)據(jù)的收布里斯托大便分類法Bristolstoolscale依據(jù)糞便不同形態(tài)和質(zhì)地進(jìn)行分類的一種方法，從1型最硬糞塊到7型水樣便共分7種類型，常以圖片展示和文字描述的視覺性圖表形式呈現(xiàn)。注：又稱Bristol評(píng)分。批次lot在規(guī)定限度內(nèi)具有同一性質(zhì)和質(zhì)量，并在同一連續(xù)生產(chǎn)周期中生產(chǎn)出來的一定數(shù)量的生物樣本為一批次。2DB32/T5062—2025香農(nóng)-威納指數(shù)ShannonWienerindex從物種種類數(shù)和均勻性（各物種的相對(duì)比例）兩方面來衡量群落物種多樣性的一項(xiàng)指標(biāo)，該指數(shù)越大代表群落的物種多樣性越高。保存液tabilizer能保存糞便微生物固相和核酸物質(zhì)的化學(xué)試劑。注：保存液的主要作用為：a）固定微生物，使微生物不能繼續(xù)生長(zhǎng)變化，相關(guān)蛋白酶等失去活性；b）保護(hù)脫氧核糖核酸（DNA穩(wěn)定DNA使其不易發(fā)生降解和變異。4基本要求4.1從事人類腸道菌群樣本制備和保藏活動(dòng)的生物樣本庫應(yīng)符合GB19489、GB/T37864和WS233的規(guī)定，相關(guān)設(shè)備、環(huán)境和消毒隔離應(yīng)滿足普通型BSL-2實(shí)驗(yàn)室要求，所有腸道菌群樣本制備用設(shè)備、耗材和所在環(huán)境應(yīng)保證無菌。4.2實(shí)施人類腸道菌群樣本制備和保藏的人員應(yīng)符合GB/T41908和GB/T41910的規(guī)定。4.3應(yīng)建立質(zhì)量管理體系規(guī)范人類糞便樣本采集和質(zhì)量控制，以及人類腸道菌群樣本制備、質(zhì)量控制和保藏的全過程。4.4人類腸道菌群樣本制備和保藏過程中產(chǎn)生的各類數(shù)據(jù)應(yīng)及時(shí)、準(zhǔn)確和清晰地記錄、保存和備份。4.5應(yīng)對(duì)樣本捐贈(zèng)人提供足夠的隱私保護(hù)，樣本捐贈(zèng)人信息管理應(yīng)符合GB/T39725的規(guī)定。5.1方案制定在生物樣本采集前，應(yīng)明確生物樣本采集目的、種類、數(shù)量、時(shí)間和周期，明確樣本捐贈(zèng)人的納入排除標(biāo)準(zhǔn)，制定詳細(xì)的生物樣本采集、處理、質(zhì)量控制和保藏方案。5.2知情同意生物樣本采集和保藏項(xiàng)目應(yīng)通過倫理審查，招募人員應(yīng)接受規(guī)范化培訓(xùn)，應(yīng)使用樣本捐贈(zèng)人能夠理解的簡(jiǎn)明語言傳達(dá)信息，使他們了解采集樣本的風(fēng)險(xiǎn)、獲益和可能產(chǎn)生的后果，使其知情并征得其同意，信息應(yīng)包括但不限于：——捐贈(zèng)人納入排除標(biāo)準(zhǔn)；——捐贈(zèng)人準(zhǔn)備說明；——捐贈(zèng)人知情同意要求；——捐贈(zèng)人的權(quán)利、義務(wù)、風(fēng)險(xiǎn)和可能產(chǎn)生的后果；——生物樣本采集種類、數(shù)量、采集容器類型和采集方法等采集內(nèi)容；——糞便樣本接收標(biāo)準(zhǔn)；——保護(hù)捐贈(zèng)人個(gè)人信息的政策；——特殊處理要求等其他需要溝通的內(nèi)容。DB32/T5062—202535.3糞便樣本糞便采集地點(diǎn)宜鄰近樣本質(zhì)量控制和制備的實(shí)驗(yàn)室。捐贈(zèng)人解大便前應(yīng)先進(jìn)行手部清潔并排盡尿液，宜使用潔凈的蹲式便器，在其內(nèi)放置一個(gè)內(nèi)徑不低于10cm，體積不低于500mL，無菌，具有易于開啟且密封性良好蓋子的采集容器，打開采集容器蓋子，將糞便排入采集容器。采集完成后即時(shí)密閉采集容器，將糞便樣本、樣本相關(guān)信息和知情同意書交實(shí)驗(yàn)人員。5.3.2質(zhì)量控制5.3.2.1稱量并記錄糞便樣本重量，每份樣本不低于100g為合格。5.3.2.2觀測(cè)糞便樣本性狀，不應(yīng)混合污染物，如尿液、污水和消毒劑等異物。樣本。5.3.2.4每批次糞便樣本應(yīng)留樣，用于質(zhì)量控制和溯源。5.3.2.5每批次糞便樣本應(yīng)隨機(jī)抽樣1份，按表1進(jìn)行質(zhì)量控制檢測(cè)；長(zhǎng)期捐贈(zèng)人的糞便樣本應(yīng)每2個(gè)月另行隨機(jī)抽樣1份留樣，按表2進(jìn)行質(zhì)量控制檢測(cè)。表1每批次糞便樣本質(zhì)量合格項(xiàng)目指標(biāo)質(zhì)量控制項(xiàng)目結(jié)果檢測(cè)方法寄生蟲未檢出鏡檢法蟲卵未檢出鏡檢法夏科萊登結(jié)晶未檢出鏡檢法孢子未檢出鏡檢法菌絲未檢出鏡檢法隱血陰性免疫法霍亂弧菌陰性培養(yǎng)法副溶血弧菌陰性培養(yǎng)法沙門氏菌陰性培養(yǎng)法志賀氏菌陰性培養(yǎng)法大腸埃希菌O157陰性培養(yǎng)法輪狀病毒抗原陰性免疫法表2長(zhǎng)期捐獻(xiàn)糞便樣本捐贈(zèng)人每2個(gè)月糞便樣本質(zhì)量合格項(xiàng)目指標(biāo)質(zhì)量控制項(xiàng)目結(jié)果檢測(cè)方法菌群多樣性菌群種類數(shù)≥200種香農(nóng)-威納指數(shù)>4.0測(cè)序法幽門螺桿菌陰性測(cè)序法艱難梭菌陰性測(cè)序法彎曲菌陰性測(cè)序法45.3.2.6所有項(xiàng)目均合格者為合格糞便樣本。標(biāo)識(shí)不合格糞便樣本，標(biāo)識(shí)由不合格糞便樣本制備的腸道菌群樣本為不合格腸道菌群樣本。5.3.2.7不合格糞便和腸道菌群樣本應(yīng)單獨(dú)存放在不合格區(qū)，執(zhí)行銷毀并記錄。5.4腸道菌群樣本5.4.1.1新鮮糞便樣本應(yīng)在采集后30min內(nèi)開始制備腸道菌群樣本，從糞便排出體外至菌液制作完成應(yīng)保證在2h以內(nèi)。5.4.1.2腸道菌群樣本制備應(yīng)按照以下程序操作。a）稀釋：每次取不少于50g糞便置于一個(gè)無菌容器，加入3倍~5倍質(zhì)量的無菌生理鹽水。b）攪拌：使用無菌電動(dòng)攪拌器以450r/min~900r/min攪拌10min，充分混勻。d）離心：4500r/min離心5min，生物安全柜內(nèi)去上清，加入400mL生理鹽水相同條件再次離心去上清。e）分裝：離心后得到的菌群沉淀可分裝成菌液、干粉膠囊或液體膠囊三種類型。1）菌液：稱量菌群沉淀重量，按1g菌群加10mL保存液的比例加入保存液，用無菌攪拌棒充分混勻?yàn)榫?，將菌液?0mL/管分裝到無菌耐低溫50mL離心管或注射器。2）干粉膠囊（平板凍干法稱量菌群沉淀重量，按1g菌群加5mL保存液的比例加入保存液，用無菌攪拌棒充分混勻?yàn)榫?。將菌液倒入無菌培養(yǎng)皿中，蓋好培養(yǎng)皿蓋，-80℃冷凍菌液2h~3h為固體后取出，打開培養(yǎng)皿蓋，將培養(yǎng)皿放入真空干燥機(jī)中干燥后取出，用無菌藥勺刮取干燥后的菌群，使用膠囊灌裝器按0.5g/粒將菌群干粉裝入羥丙甲基纖維素膠囊殼，將制作好的膠囊按需裝瓶，在瓶中加入適量干燥劑。3）干粉膠囊（旋轉(zhuǎn)凍干法稱量菌群沉淀重量，按1g菌群加5mL保存液的比例加入保存液，用無菌攪拌棒充分混勻?yàn)榫海瑢⒕旱谷霟o菌茄形瓶中，將茄形瓶置于低溫旋動(dòng)儀旋轉(zhuǎn)冷凍，使菌液均勻凝固在茄形瓶?jī)?nèi)表面，后置于T型冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，用無菌藥勺刮取干燥后的菌群，使用膠囊灌裝器按0.5g/粒將菌群干粉裝入羥丙甲基纖維素膠囊殼，將制作好的膠囊按需裝瓶，在瓶中加入適量干燥劑。4）液體膠囊：稱量菌群沉淀重量，按1g菌群加1mL保存液的比例加入保存液，用無菌攪拌棒充分混勻?yàn)榫?，使用移液器?.5mL/粒將菌液注入明膠膠囊殼，將制作好的明膠膠囊放入羥丙甲基纖維素膠囊殼中，將制作好的膠囊按需裝瓶，在瓶中加入適量干燥劑。f）標(biāo)識(shí)：貼標(biāo)簽標(biāo)識(shí)樣本名稱、批次、生產(chǎn)日期、保質(zhì)期和保存條件。5.4.2質(zhì)量控制5.4.2.1每批次腸道菌群樣本應(yīng)留樣，用于質(zhì)量控制和溯源。5.4.2.2每批次腸道菌群樣本應(yīng)隨機(jī)抽樣1份按表3進(jìn)行質(zhì)量控制。表3每批次腸道菌群樣本質(zhì)量合格項(xiàng)目指標(biāo)質(zhì)量控制項(xiàng)目菌液結(jié)果膠囊結(jié)果檢測(cè)方法外觀懸濁液整潔，不應(yīng)有黏結(jié)、變形、滲漏或囊殼破裂目檢法活菌數(shù)不小于2.5×10個(gè)/50mL不小于1×10個(gè)/g流式細(xì)胞法細(xì)菌活性不低于80%不低于70%流式細(xì)胞法55.4.2.3腸道菌群樣本對(duì)應(yīng)的父代糞便樣本按5.3.2.5質(zhì)量控制有不合格項(xiàng)的被視為不合格腸道菌群樣本。5.4.2.4所有項(xiàng)目均合格者為合格樣本。標(biāo)識(shí)不合格樣本，不合格樣本應(yīng)單獨(dú)存放在不合格區(qū)，執(zhí)行銷毀并記錄。6.1腸道菌群樣本-20℃保藏期限最長(zhǎng)為1個(gè)月，-80℃保藏期限最長(zhǎng)為12個(gè)月。6.2留樣的糞便和腸道菌群樣本應(yīng)-80℃保存至少12個(gè)月。6.3超過保藏期限的樣本應(yīng)執(zhí)行銷毀并記錄。7數(shù)據(jù)管理附錄B。7.2應(yīng)建立、成文并實(shí)施人類腸道菌群樣本相關(guān)數(shù)據(jù)的傳輸和接收程序，數(shù)據(jù)傳輸應(yīng)確保其完整性并防止侵犯數(shù)據(jù)隱私。數(shù)據(jù)傳輸前，應(yīng)就數(shù)據(jù)的采集和接收與有關(guān)各方達(dá)成工作協(xié)議。7.3人類腸道菌群樣本相關(guān)數(shù)據(jù)應(yīng)經(jīng)數(shù)據(jù)清洗后儲(chǔ)存，數(shù)據(jù)清洗包括補(bǔ)充完整缺失值，復(fù)核異常值，合并或刪除重復(fù)數(shù)據(jù)，以及更正不規(guī)范數(shù)據(jù)等。7.4人類腸道菌群樣本相關(guān)數(shù)據(jù)應(yīng)有備份，原份和備份數(shù)據(jù)應(yīng)至少保存20年。DB32/T5062—20256（資料性）布里斯托大便分類法表A.1給出了布里斯托大便分類法示意。表A.1布里斯托大便分類法示意類型圖片示例描述備注1一顆顆硬球便秘正常2像一串葡萄，表面凹凸，質(zhì)地較硬3像玉米，表面有裂痕4像香腸，表面光滑，質(zhì)地較軟5像雞塊，質(zhì)地柔軟的半固體6像粥，無固定外形7水狀，完全液體無固體腹瀉DB32/T5062—20257（資料性）數(shù)據(jù)記錄明細(xì)B.1項(xiàng)目倫理批件和相關(guān)文件。B.2捐贈(zèng)人數(shù)據(jù)包括捐贈(zèng)人編號(hào)、知情同意書、訪談?dòng)涗?、一般人口學(xué)信息、臨床診療信息、捐贈(zèng)前7天的身體情況、飲食情況、用藥情況、排便情況、心理壓力情況、每次捐獻(xiàn)時(shí)間、每次捐贈(zèng)時(shí)體溫。B.3樣本采集和接收數(shù)據(jù)包括糞便樣本編號(hào)、采集容器類型、采集時(shí)間、采集人員、糞便重量、糞便形狀和顏色、布里斯托大便分類、接收時(shí)間、接收人員。B.4樣本制備數(shù)據(jù)包括腸道菌群樣本制備方法、腸道菌群樣本編號(hào)、批次號(hào)、重量、數(shù)量、分裝后體積或膠囊數(shù)量、制備時(shí)間、制備人員。B.5樣本質(zhì)量控制數(shù)據(jù)包括糞便和腸道菌群樣本質(zhì)量控制檢測(cè)結(jié)果、質(zhì)量控制時(shí)間、質(zhì)量控制人員。B.6樣本保藏?cái)?shù)據(jù)包括入庫時(shí)間、入庫位置、入庫人員、保藏期間溫度、出庫時(shí)間、出庫人員。B.7突發(fā)事件數(shù)據(jù)包括突發(fā)事件內(nèi)容、時(shí)間、地點(diǎn)、處理方法、處理結(jié)果、處理人員。DB32/T5062—20258［1］史以超，王子愷，楊云生.消化道微生態(tài)標(biāo)準(zhǔn)化樣本庫共識(shí)［J］.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志，2018，7（04［2］尚紅，王毓三，申子瑜.全國(guó)臨床［3］國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)醫(yī)院管理研究所，中華醫(yī)學(xué)會(huì)腸外腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)腸外腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)學(xué)分會(huì)腸道微生態(tài)協(xié)作組.腸道菌群移植臨床應(yīng)用管理中國(guó)專家共識(shí)（2022版J］.中華胃腸外科［4］中華醫(yī)學(xué)會(huì)腸外腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)學(xué)分會(huì)，上海預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)微生態(tài)專業(yè)委員會(huì).腸道菌群移植供體篩cn441530-20220606-002［5］郭智，王鈞，王強(qiáng).中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腸道微生態(tài)技術(shù)整合診治指南（精簡(jiǎn)版J］.中國(guó)腫瘤臨床，［7］中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)醫(yī)院感染控制分會(huì).臨床微生物標(biāo)本采集和送檢指南［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜［9］