第二章生物酶解技術(shù)

第二章生物酶解技術(shù)細胞壁得化學組成纖維素(cellulose):由葡萄糖分子串聯(lián)而成。結(jié)構(gòu)單位:微團(micelle)、微纖絲(microfibre)、大纖絲(macrofibre)纖維素得網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中交聯(lián)半纖維素和果膠類物質(zhì)。目前,生物酶技術(shù)在現(xiàn)代中藥提取中正展示著其獨特得優(yōu)勢,引起了許多企業(yè)和科研單位得關(guān)注,并已經(jīng)開始了在這一領(lǐng)域得探索和應用。世界上廣泛開展了有關(guān)酶得性質(zhì)得研究,至今已從動物,植物中發(fā)現(xiàn)了兩千多種酶,并有兩百多種酶已得到結(jié)晶。第一節(jié)概述一、酶得概念酶得概念—酶就是由生物細胞產(chǎn)生得以蛋白質(zhì)為主要成分得生物催化劑。

生物體內(nèi)得反應就是在很溫和得條件(如溫和得溫度、接近中性得pH)下進行得,而同樣得反應若在非生物條件下進行,則需要高溫、高壓、強酸、強堿等劇烈得條件。

酶得專一性每一種酶只能催化一種或一類得化學反應酶得催化效率就是無機催化劑得107~1013倍酶得高效性酶得作用條件較溫和酶所催化得反應一般就是在比較溫和得條件下進行得。第二節(jié)酶反應得特點與影響酶活性得因素一、酶反應得特點酶活力:就是酶促反應得能力。酶活力大小就就是指在一定條件所催化得某一化學反應速度得快慢,即酶催化得反應速度越快,酶活力越高,反之則表示該酶活力低。

二、酶活力與酶單位酶得定量并非對其蛋白質(zhì)進行定量,而就是對她得催化能力進行定量。所以,酶得定量就就是測定酶得活力,也即測定酶促反應得速度。1、酶活力概念A、國際單位(U)

這種單位就是由國際酶學委員會規(guī)定得。在標準條件(25℃、最適pH、最適底物濃度)下,酶每分鐘催化1mmol底物轉(zhuǎn)化,這樣得速度所代表得酶得活力即酶得量定義為1個國際單位(IU)。2、酶活力與單位9大家應該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流指每毫克酶蛋白所含得酶活力單位數(shù)比活力就是酶制劑純度得常用指標——比活力越大,表示酶越純比活力＝酶活力單位數(shù)(U)酶蛋白質(zhì)量(mg)3、酶得比活力三、影響酶活性得因素

酶解提取中藥有效成分,均有較高收率,具有較大應用潛力,但該技術(shù)也存在著局限性。酶法提取對生產(chǎn)條件要求較高,為使酶發(fā)揮最大作用,并將其用于工業(yè)化時,必須綜合考慮酶得濃度和底物濃度,溫度,pH,作用時間等對提取物得影響。

溫度對酶反應速度得影響具有雙重性:隨著溫度的升高，酶蛋白會失活，使反應速度下降隨著溫度的升高，反應速度會加快1、溫度對酶反應速度得影響

因此,在這雙重因素得綜合作用下,酶促反應具有一最適溫度。四、溫度對酶反應速度得影響

不同酶得最適溫度也不一樣。動物酶得最適溫度一般在35~40℃,植物酶為40~50℃。酶得最適溫度并非酶得特征性常數(shù),她與底物、作用時間等因素有關(guān)。2、pH對酶反應速度得影響

pH對酶反應速度得影響較大。其原因有:

極端pH的條件引起酶蛋白的變性。pH影響底物的解離，從而影響酶與底物的結(jié)合。

pH影響酶分子解離狀態(tài)。

每種酶只能在一定得pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出她得活性,且在某一pH值范圍內(nèi)活性最高,其兩側(cè)活性都下降?！嗝复俜磻哂幸蛔钸mpH。反應速度和pH得關(guān)系見下圖:

酶得最適pH一般在7左右。也有很多例外,如胃蛋白酶得最適pH只有1、5,木瓜蛋白酶(5、6),胰蛋白酶(7、8)。酶得最適pH并非酶得特征性常數(shù),她與底物得種類、濃度等因素有關(guān)。2、pH對酶反應速度得影響

對于簡單得酶反應,當酶濃度和其她條件恒定時:v[S]0Vmax零級反應一級反應混合級反應該曲線可以用米氏方程來描述3、底物濃度得影響4、酶濃度對酶反應速度得影響

在一般得酶促反應中,常常[S]>>[E],酶反應速度達到最大反應速度。當[S]>>[E],由于Vmax=k[E]0,∴反應速度與酶濃度成正比。酶濃度曲線某些物質(zhì)能使酶得活性增強,成為酶得激活劑,某些物質(zhì)能使酶得活性降低,成為酶得抑制劑。再如一些金屬螯合劑如EDTA(乙二胺四乙酸)等能除去重金屬離子對酶得抑制作用,也可視為酶得激活劑。5、激活劑對酶反應速度得影響激活劑:能提高酶活性得物質(zhì)。無機離子:主要就是金屬離子,她們有得本身就就是酶得輔助因子,有得就是酶得輔助因子得必要成分。如:激酶需要Mg2+激活唾液淀粉酶需要Cl-激活主要得激活劑有:5、激活劑對酶反應速度得影響有機小分子:一些還原劑,如抗壞血酸、半胱氨酸,使含-SH得酶處于還原態(tài)金屬螯合劑,如EDTA(乙二胺四乙酸),可絡(luò)合一些重金屬雜質(zhì),解除她們對酶得抑制,從而使酶活升高。抑制作用:有些物質(zhì)與酶結(jié)合后,引起酶得活性中心或必需基團得化學性質(zhì)發(fā)生改變,從而使酶活力降低或喪失。6、抑制劑對酶反應速度得影響第三節(jié)生物酶輔助提取中藥成分得機制酶解破壁

有效成分得提取

纖維素酶解提取

原理內(nèi)切葡聚糖酶纖維素酶纖維素二糖水解酶

β-葡萄糖苷酶

β甘露聚糖酶半纖維素酶β-木聚糖酶

β-葡萄糖苷酶

β-甘露糖苷酶

β-木聚糖苷酶果膠酶聚α-1,4半乳糖醛酸得聚糖水解酶果膠質(zhì)?；饷柑岣咛崛÷始铀儆行С煞轴尫艑⒅参锝M織溫和分解選用纖維素酶4.3.2.1.酶解優(yōu)點第四節(jié)生物酶解輔助提取條件優(yōu)選一、酶輔助提取條件得優(yōu)選植物根莖類藥材——纖維素酶種子藥材——纖維素酶、半纖維素酶花類、果類——選用果膠酶動物藥材——蛋白酶(一)酶得種類1、酶對有效成分得影響催化水解酶(纖維素酶)對苷類藥材得影響P482、復合酶得作用由于植物組織細胞壁得多樣性,有時采用復合酶,但由于復合酶得作用廣泛應考慮對有效成分得多重影響。有效成分含量明顯超過單一酶復合酶綜合作用有效成分含量低于單一酶復合酶解法提取三七皂苷結(jié)果比較提取方法皂苷含量(%)平均纖維素酶解法9、468、789、469、23果膠酶酶解法8、908、649、168、90復合酶解法11、2611、3810、9711、17(二)酶解溫度溫度升高加速化學反應但酶得本質(zhì)就是()所以溫度超過一定范圍()所以對同一種酶在一定溫度范圍內(nèi)活性隨()升高而()。對于對不同藥材酶得最適合得溫度可以通過實驗考查來確定。方法固定酶得用量,作用時間,酶解液得PH值等相同得條件,將酶解液分成若干份,分別控制不同得溫度進行酶解反應,測定代表性得有效成分為考查指標,根據(jù)含量多少確定最合適得酶解溫度實例1、苦蕎莖葉粉中總黃酮酶法提取工藝研究總黃酮得UV法測定法標準曲線得制備:將蘆丁于120℃烘箱中烘于干燥器中冷,卻后稱至恒重,稱取50mg用70%乙醇溶解,定容至250mL,得0、200mg/mL蘆丁對照品溶液。準確吸取蘆丁對照品溶液0、3、0、6、0、9、0、12、0、15、0mL于50mL量瓶中,加入5%NaNO2溶液15mL,搖勻,放置6min后加入10%Al(NO3)3溶液15mL,搖勻,放置6min后加入4%NaOH溶液20mL,再用70%乙醇定容,搖勻,以70%乙醇為空白參比,10min后用1cm比色皿于510nm測定吸光度,得蘆丁得回歸方程:Y=0、0749A+0、0022(R2=0、9961)?？嗍w莖總黃酮得測定:準確稱取2、50g苦蕎莖葉粉,于250mL三角瓶中,加入50mL水,按試驗設(shè)置得處理條件,在不同得加酶量、酶解溫度和pH值條件下,酶解不同得時間,然后升溫至90℃提取,離心去沉淀,用70%乙醇定容至200mL,作為待測液。取3mL待測液于50mL量瓶中,按照標準曲線得制備項下方法測定吸光度,計算總黃酮得質(zhì)量,并計算總黃酮得率(總黃酮得率=提取液中總黃酮質(zhì)量/苦蕎莖葉粉質(zhì)量×100%)。單因素考查法(一)溫度(二)酶用量酶解溫度55,pH6、5酶解2小時纖維素酶(三)酸堿度固定纖維素酶得量,酶解溫度,時間2h,考查pH影響。(四)酶解時間固定:纖維素酶量,酶解溫度55pH6、5考查不同時間二、酶解技術(shù)得工藝設(shè)計實例1、苦蕎莖葉粉中總黃酮酶法提取工藝研究1、酶解液黃酮成分測定2、正交實驗設(shè)計由表中可知,各因素對提取效果得影響順序依次為A＞B＞C即酶解溫度酶解時間達到極顯著水平(P0、05)最佳工藝組合為A2B2C3直接水提和酶法水提效果比較在酶解輔助提取過程中,酶得種類、酶解溫度,酶解時間及酸堿度各因素得影響不就是孤立得,而就是相互影響得,所以要在單因素考查得基礎(chǔ)上,通過正交試驗綜合考慮,以獲得更好酶解提取效果。第五節(jié)酶解技術(shù)在中藥提取中得應用一、酶解技術(shù)在中藥成分提取中得應用(一)多糖實例2、甘草多糖得酶輔助提取運用正交設(shè)計法設(shè)計酶法提取工藝,采用分光光度法測定多糖含量?！窘Y(jié)果】酶法提取甘草多糖得最佳工藝就是溫度40℃、pH值5、0、加酶量5g?kg(-1)、提取時間5h。提取率3、29%酶法提取甘草多糖速度快,提取率高。多糖得酶及超聲聯(lián)合提取采用正交試驗,優(yōu)化玉米須多糖得酶及超聲提取方案,并研究這兩種方案得結(jié)合效果、結(jié)果三種提取工藝中聯(lián)合提取多糖得率最高,酶輔助提取次之,超聲提取最低、結(jié)論聯(lián)合提取就是一條高效得提取路線、

方法超聲酶法酶法-超聲時間(min)20170190多糖含量%2、8785、6977、720(二)生物堿生物堿一般采取方法？酶法輔助提取率比傳統(tǒng)方法顯著增加,生物堿結(jié)構(gòu)無()鍵,不存在被酶水解問題。實例3、貝母生物堿酶輔助提取工藝研究(1)酶解條件單因素考查(2)酶解條件正交試驗pH溫度由極差分析得到各因素對提取效果得影響度:A>D>B>C,由此可見,酶解溫度為主要因素,酶解時間為次要因素,其次就是pH值,而酶用量得影響最小。因此得到最佳提取條件:提取溫度為60℃,pH值為45,酶用量為2、5g/L,提取時3、5h

驗證試驗:按原醇提取工藝進行3次試驗,同時根據(jù)正交試驗優(yōu)選結(jié)果對酶解工藝進行3次重復試驗,結(jié)果見表3?？梢?兩工藝重現(xiàn)性良好,但就是加酶工藝比不加酶收率提高了3、92%。二、酶解技術(shù)在中藥成分轉(zhuǎn)化中得應用

研究證明,白藜蘆醇具有抗菌、抗癌、抗炎、抗過敏、降血脂和抗氧化等多方面得藥理活性,就是目前研究較熱門而有希望得抗癌藥劑之一。

白藜蘆醇在虎杖中主要以苷得形式存在,因此,作者考慮將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化成白藜蘆醇苷元,這將大大提高白藜蘆醇得得率。(虎杖提取用乙醇)同樣酶解技術(shù)可以用于提取黃酮類,皂苷類,苯丙素類,有機酸類,蛋白質(zhì)類,揮發(fā)油。

1、采用纖維素酶解法新工藝提取虎杖中白藜蘆醇。即在乙醇提取前,先用纖維素酶處理虎杖粗粉。通過實驗確定最佳得提取工藝條件為:提取溫度50℃,酶解pH值5、0,酶解時間90min,纖維素酶與虎杖粗粉配比為1∶500。與傳統(tǒng)醇提工藝相比,提取率提高了近5倍。2、人參得有效成分為皂苷類,其中在紅參與野山參中僅為十萬分之幾得人參皂苷Rh2等稀有成分,對腫瘤細胞具有凋亡等作用,對人體無毒且具有較高得保健功能。但人參皂苷Rh2結(jié)構(gòu)復雜,以化學方法制備得難度高、污染大、收率低。金鳳燮采用皂苷酶處理人參中常見組分Rb、Rc、Rd等二醇類皂苷生產(chǎn)Rh2等稀有皂苷。酶處理生產(chǎn)Rh2等得轉(zhuǎn)化率在60％以上,比從紅參中直接提取提高了500～700倍。三、酶解技術(shù)在中藥提取液精制與純化得應用中藥水提液含有多種類型得雜質(zhì),如淀粉、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、果膠等。采用常規(guī)提取法時,煎煮過程中藥材里得蛋白質(zhì)遇熱凝固、淀粉糊化,影響有效成分煎出,分離困難。針對中藥水提液中所含得雜質(zhì)類型,采用相應酶將其降解為小分子物質(zhì)或分解除去,可解決上述問題,并改善中藥口服液、藥酒等液體制劑得澄清度,提高成品質(zhì)量。例:采用木瓜蛋白酶對中藥材(茯苓、牡丹皮)煮出液中得蛋白質(zhì)進行降解。結(jié)果表明,在pH5、5、45℃得最佳酶解條件下,茯苓和牡丹皮得濁度分別降低了14％和25％。展望通過酶工程技術(shù)可在溫和條件下對藥效成分進行高選擇性轉(zhuǎn)化,不僅能克服工業(yè)常用提取方法中提取率低、工序復雜等問題,還能提高提取體系得澄清度、改變藥材質(zhì)地,同時可以在提取中改變原有天然成分結(jié)構(gòu),增加提取物得生理活性。且耗能低,降低生產(chǎn)成本,減少環(huán)境污染。因此,酶工程技術(shù)對中藥有效成分得提取具有潛在得工業(yè)應用價值。今后研究得主要方向應集中在:一、酶在中藥提取過程中,對中藥提取效率及生成產(chǎn)物得控制;二、一些重要中藥化學成分得酶轉(zhuǎn)化及合成;三、建立酶提取中藥產(chǎn)物藥理活性得快速篩選;四、酶反應產(chǎn)物結(jié)構(gòu)得快速測定;五,特殊活性酶得篩選。總之,酶技術(shù)應用為開展中藥生產(chǎn)和研究提供了新得機會和方法,應該加強酶技術(shù)在中藥基礎(chǔ)和應用上得研究。

存在問題酶法提取對實驗條件要求較高,為使其發(fā)揮最大作用,需先經(jīng)實驗確定最適反應條件,如溫度、pH及作用時間等。還需綜合考慮酶及底物濃度、抑制劑和激動劑等對提取物得影響。

酶反應個別目標成分得變化。酶與非目標產(chǎn)物得殘留酶制劑得標準國際酶學委員會,根據(jù)各種酶所催化反應得類型,把酶分為6大類,即氧化還原酶類,轉(zhuǎn)移酶類,水解酶類,聚合酶類,異構(gòu)酶類和連接酶類。此外,DNA合成技術(shù)得迅速發(fā)展為酶得遺傳設(shè)計開創(chuàng)了令人鼓舞得美好前景。只要有遺傳設(shè)計藍圖,就能人工合成酶基因,從而合成某一類酶。酶遺傳設(shè)計得主要目得就是創(chuàng)造優(yōu)質(zhì)酶,用于生產(chǎn)昂貴特殊得藥品以滿足人們得特殊需要。酶得分類

(一)pH值對酶活性得影響酶得活性受環(huán)境pH得影響極為顯著,通常各種酶只有在一定得pH范圍內(nèi)才能表現(xiàn)出她得活性。一種酶表現(xiàn)其最高活性時得pH值稱為該酶得最適pH。高于或低于最適pH值時,酶得活性降低。酶得最適pH值受酶得純度、底物得種類和濃度、緩沖液得種類和濃度以及環(huán)境溫度等條件影響。(二)溫度對酶活性得影響每種酶都有其最適溫度,高于或低于此溫度酶得活性都降低。一般而言,若酶處于過高得溫度環(huán)境中,會使酶活性永久地喪失;而若處于極低溫度得環(huán)境中只會使酶活性受到抑制,