干細(xì)胞的體外培養(yǎng)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)課件

職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)一、技術(shù)原理職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)（一）技術(shù)原理基本原則：促進(jìn)ES增殖的同時(shí)，維持其未分化的二倍體狀態(tài)。有飼養(yǎng)層（feederlayer）培養(yǎng)法：以小鼠成纖維細(xì)胞耐硫代鳥(niǎo)嘌呤和耐烏苯苷亞系（STO）或小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MouseEmbryoFirbroblasts,MEF）制備飼養(yǎng)細(xì)胞單層，主要是利用其分泌的生長(zhǎng)因子FGF和抑制干細(xì)胞分化因子白血病抑制因子（LIF）共同作用，保持干細(xì)胞在體外克隆而不分化。無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)法：利用各種能分泌抑制分化因子的細(xì)胞制備條件培養(yǎng)基或在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入重組的LIF制備條件培養(yǎng)基。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)二、基本過(guò)程職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)飼養(yǎng)層細(xì)胞制備或條件培養(yǎng)基制備胚胎的制備和培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的分離胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的鑒定凍存與復(fù)蘇細(xì)胞克隆形態(tài)堿性磷酸酶檢測(cè)核型的鑒定分化能力的觀察嵌合能力的測(cè)定職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)1、飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）：取孕12.5-14.5d鼠胚胎軀干，以植塊培養(yǎng)法或分散細(xì)胞培養(yǎng)法制備，取第三代至第五代細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。STO細(xì)胞：按照一般已建細(xì)胞系培養(yǎng)方法。DMEM加10%小牛血清作為培養(yǎng)液。采用胎數(shù)多小鼠一次大量培養(yǎng)MEF凍存，用時(shí)復(fù)蘇。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)MEF和STO的優(yōu)缺點(diǎn)：MEF分泌促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖和抑制分化因子的能力比STO強(qiáng)，STO作飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)常需在培養(yǎng)基中加入LIF。MEF不能長(zhǎng)期傳代，需經(jīng)常準(zhǔn)備懷孕小鼠制備第三代至第五代細(xì)胞，STO則可長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。MEF不具耐藥性，不能作為轉(zhuǎn)染外源性基因的胚胎干細(xì)胞篩選用。SNL細(xì)胞為轉(zhuǎn)染了neor抗性基因和LIF基因的STO細(xì)胞，可分泌足夠的抑制分化因子，并因帶有neor抗性基因可用于轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞篩選。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，死亡MEF或STO的染色體可能導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞的突變及影響正常核型的保持。不易獲得純的胚胎干細(xì)胞作為生化和分子生物學(xué)方面的分析。使用前如用絲裂霉素C處理，如清洗不徹底，殘余的絲裂霉素C會(huì)影響胚胎干細(xì)胞的增殖。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)2、飼養(yǎng)單層制備MEF或STO連成一片，以含10μg/ml絲裂霉素培養(yǎng)液370C作用2-3h（如細(xì)胞層較薄，也可縮短至30min-1.5h），或γ射線照射（劑量為30-100Gy）。棄含絲裂霉素培養(yǎng)液，PBS洗5次，γ射線處理者不用清洗。消化細(xì)胞，制備懸液種植至用0.1%明膠處理過(guò)（0.1%明膠水溶液覆蓋培養(yǎng)瓶表面，室溫2h以上）的培養(yǎng)瓶，種植細(xì)胞數(shù)：MEF7.5×104-105個(gè)/cm2，STO為5×104個(gè)/cm2。培養(yǎng)至細(xì)胞連成一片沒(méi)有間隙（中間可補(bǔ)加處理過(guò)的細(xì)胞），制備好的飼養(yǎng)單層置培養(yǎng)箱，5天內(nèi)使用，使用前換成干細(xì)胞培養(yǎng)液。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)觀察：好的飼養(yǎng)單層，細(xì)胞連成一片，無(wú)間隙，死亡細(xì)胞和雜細(xì)胞極少。MEF和STO產(chǎn)生的抑制分化因子一部分分泌到培養(yǎng)液中，一部分錨定在細(xì)胞外基質(zhì)上。無(wú)間隙的飼養(yǎng)單層保證了胚胎干細(xì)胞都能與飼養(yǎng)層細(xì)胞接觸而達(dá)到最佳效果。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)3、用于培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基直接在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液中加入重組的LIF，使終濃度為1000U/ml。Baffalo大鼠肝細(xì)胞株BRL條件培養(yǎng)基（BRL-CM):能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干細(xì)胞分化的因子DIF。收集培養(yǎng)72h的培養(yǎng)液，過(guò)濾除菌，用前6-7份+3-4份胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液，再添加8-10%胎牛血清。年齡2-3周大鼠心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)基（RH-CM）：分泌抑制胚胎干細(xì)胞分化因子。收集1-6代細(xì)胞培養(yǎng)液，過(guò)濾除菌，用前6份+3份胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液+1份胎牛血清。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)4、胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)（1）培養(yǎng)液配制培養(yǎng)液要用超純水或五蒸水，不能有細(xì)菌內(nèi)毒素污染，水要現(xiàn)用現(xiàn)制。高糖DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，葡萄糖濃度為（4.5g/L）：有助于囊胚貼壁、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)增殖及胚胎干細(xì)胞集落形成。使用前還要添加β-巰基乙醇（0.1mmol/L）或單硫甘油（0.15mmol/L）：保護(hù)細(xì)胞內(nèi)酶和蛋白質(zhì)中的巰基不被氧化，促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的貼壁和克隆形成。使用前要添加15%胎牛血清：必不可少，但也有缺點(diǎn)。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)血清缺點(diǎn)：成分復(fù)雜，不利于整合到胚胎干細(xì)胞基因組中外源性基因功能的測(cè)定；可能含有一些未知的促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化的因子；含有微量的血紅蛋白和內(nèi)毒素，干擾胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)。無(wú)血清胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液無(wú)上述缺點(diǎn)，但細(xì)胞貼附力不如有血清培養(yǎng)基。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)（2）胚胎干細(xì)胞的分離小鼠：母小鼠超數(shù)排卵交配（注射孕馬血清促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素）胚胎采集：取孕3.5d（囊胚期或桑椹期）的母小鼠取胚胎胚胎培養(yǎng)：培養(yǎng)皿內(nèi)制備直徑0.5cm左右露滴狀培養(yǎng)液液滴，并覆蓋透明石蠟油，胚胎置于液滴中培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞分離：普通分離法、免疫外科法，棄除滋胚層細(xì)胞，獲得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（innercellmass，ICM），并分散為3-4個(gè)細(xì)胞在一起的細(xì)胞團(tuán)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)（3）胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)有飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)：將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)吸置處理過(guò)的飼養(yǎng)層上，一個(gè)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)放置一個(gè)孔，370C、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)2d后出現(xiàn)小集落，并逐步增大，6-10d可消化傳代，消化時(shí)，消化30s后棄消化液，殘余消化液繼續(xù)作用，當(dāng)飼養(yǎng)單層出現(xiàn)裂隙（或顯微鏡下細(xì)胞之間分開(kāi)），終止消化，一般為2-3min加適量培養(yǎng)液，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，接種新飼養(yǎng)層擴(kuò)大培養(yǎng)。無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)：明膠包被培養(yǎng)板，條件培養(yǎng)基。已建系胚胎干細(xì)胞：將已培養(yǎng)2-3d生長(zhǎng)旺盛干細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，添加新的培養(yǎng)液，按照1：3或1：6比例轉(zhuǎn)鐘。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)注意事項(xiàng)：最初分離的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)以3-4個(gè)細(xì)胞團(tuán)為宜，但集落形成后，傳代過(guò)程中一定要消化成單細(xì)胞，否則胚胎干細(xì)胞會(huì)互相誘導(dǎo)，易于分化。培養(yǎng)條件要始終如一。為了增強(qiáng)胚胎干細(xì)胞粘附力，除明膠包被外，還可以用纖維連接蛋白和多聚賴氨酸等促進(jìn)粘附。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)（4）培養(yǎng)結(jié)果hES細(xì)胞集落（×10）胚胎干細(xì)胞呈集落狀（島嶼狀）生長(zhǎng)，邊緣整齊，表面平滑，結(jié)構(gòu)致密，隆起生長(zhǎng)，細(xì)胞之間界限不清。消化成單細(xì)胞后細(xì)胞小而圓，核大，胞漿小。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)小鼠胚胎生殖細(xì)胞的相位襯度圖像職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)小鼠胚胎生殖細(xì)胞培養(yǎng)皿含有數(shù)百個(gè)小鼠胚胎生殖細(xì)胞群的培養(yǎng)皿。每一個(gè)紅色染色的斑點(diǎn)代表一個(gè)由數(shù)百或數(shù)千個(gè)干細(xì)胞組成的個(gè)體集落。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)5、胚胎干細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇凍存液：胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液+10%-15%DMSO。凍存細(xì)胞密度：106-107個(gè)/ml凍存與復(fù)蘇方法同普通細(xì)胞。LIF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，仍然用不含LIF的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液凍存。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)三、胚胎干細(xì)胞的鑒定職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)1、ES細(xì)胞生物學(xué)特性（1）ES細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型ES細(xì)胞具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，胞體體積小，核大，有一個(gè)或幾個(gè)核仁。細(xì)胞中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，散布著大量核糖體和線粒體，核型正常，保留了二倍體性質(zhì)。正常ES細(xì)胞染色體正常，如發(fā)生異常則其很難發(fā)育分化形成動(dòng)物個(gè)體。

職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)（2）ES細(xì)胞生長(zhǎng)特性ES細(xì)胞在體外分化抑制培養(yǎng)中，呈克隆狀生長(zhǎng)，細(xì)胞緊密地聚集在一起，形似鳥(niǎo)巢，細(xì)胞界限不清，克隆周圍有時(shí)可見(jiàn)單個(gè)ES細(xì)胞和分化的扁平狀上皮細(xì)胞。

ES細(xì)胞增殖迅速，每18—24h分裂增殖1次。此外，其還可以在體外進(jìn)行選擇、操作、凍存。凍存的細(xì)胞可在需要時(shí)隨時(shí)解凍，繼續(xù)培養(yǎng)不失其原有特性，并且來(lái)自一個(gè)克隆的細(xì)胞具有同樣的特征。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)（3）ES細(xì)胞的高度分化潛能ES細(xì)胞在體外需在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)才能維持其未分化狀態(tài)，一旦脫離飼養(yǎng)層就自發(fā)地進(jìn)行分化。在單層培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞自發(fā)分化成多種細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)中：“簡(jiǎn)單類胚體”

“囊狀胚體”

細(xì)胞分化物。ES細(xì)胞可進(jìn)行誘導(dǎo)分化

*用RA（維生素A酸或視黃酸）作誘導(dǎo)90％以上的ES細(xì)胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，

*聚集培養(yǎng)的ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化則可分化為有節(jié)律性收縮的心肌細(xì)胞。

*將ES細(xì)胞注射到同源動(dòng)物皮下，可形成組織瘤，其細(xì)胞組成可代表3個(gè)胚層細(xì)胞。

*用ES細(xì)胞作核供體進(jìn)行細(xì)胞核移植，可以得到可發(fā)育重構(gòu)胚和動(dòng)物個(gè)體。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

（4）堿性磷酸酶的表達(dá)

許多資料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚細(xì)胞和囊胚細(xì)胞均有堿性磷酸酶（AKP）表達(dá)，小鼠的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中均含有豐富的AKP。而在已分化的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中AKP呈弱陽(yáng)性或陰性。豬、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈陽(yáng)性。因此，AKP常用來(lái)作為鑒定EC細(xì)胞或ES細(xì)胞分化與否的標(biāo)志之一。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

（5）胚胎階段特異性細(xì)胞表面抗原的表達(dá)

早期胚胎細(xì)胞表面均表達(dá)胚胎階段特異性表面抗原（SSEA-1）。在胚胎的原始外胚層細(xì)胞、ES細(xì)胞、EC細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞的表面均可檢測(cè)到SSEA-1的表達(dá)。小鼠SSEA-1的表達(dá)自8細(xì)胞期開(kāi)始，直到原始外胚層形成期。早期囊胚ICM細(xì)胞全部呈強(qiáng)陽(yáng)性，晚期囊胚中部分ICM呈強(qiáng)陽(yáng)性，部分呈弱陽(yáng)性，少部分為陰性。因此，SSEA也常作為ES細(xì)胞鑒定的一個(gè)標(biāo)志。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)2、ES細(xì)胞的全能性主要體現(xiàn)在以下幾方面：

①形成畸胎瘤。將ES細(xì)胞注人同源動(dòng)物皮下可形成畸胎瘤，包括三個(gè)胚層細(xì)胞；

②形成類胚體。培養(yǎng)ES細(xì)胞在非粘附底物中懸浮生長(zhǎng)，或控制增殖細(xì)胞數(shù)目，能夠使之生成類胚體，它是一個(gè)與畸胎瘤相似的多種細(xì)胞系混雜的集合體、具有三個(gè)胚層組織；

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③直系分化。通過(guò)控制ES細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，或遺傳操縱特定基因表達(dá)，ES細(xì)胞可直接分化成某特定種系細(xì)胞，例如將神經(jīng)決定基因NeuroD2和NeuroD3轉(zhuǎn)人ES細(xì)胞，可使之分化為神經(jīng)細(xì)胞；

④形成嵌合體。將ES細(xì)胞注射到同種動(dòng)物囊胚腔中后，可以形成嵌合體（chimera），ES細(xì)胞可以參與嵌合體各個(gè)器官包括生殖腺的發(fā)育。這是檢驗(yàn)一個(gè)細(xì)胞系是否為ES細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)3、ES細(xì)胞的鑒定--細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)--核型分析--堿性磷酸酶（AKP）染色--SSEA-I免疫熒光標(biāo)記--分化能力檢測(cè)體外分化試驗(yàn)體內(nèi)分化試驗(yàn)嵌合體形成試驗(yàn)核移植試驗(yàn)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

（1）ES細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定依ES細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)（胞體體積小，核大、有一個(gè)或幾個(gè)核仁）和生長(zhǎng)特性（呈克隆狀生長(zhǎng)，細(xì)胞緊密聚集，形似鳥(niǎo)巢，界限不清）對(duì)ES細(xì)胞進(jìn)行初步鑒定。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

（2）核型分析

ES細(xì)胞具有正常二倍體核型，可用核型分析進(jìn)行檢驗(yàn)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

（3）堿性磷酸酶（AKP）染色原理：AKP在堿性條件（pH9.0-9.6）下能使孵育液中的α-磷酸奈酚鈉水解，產(chǎn)生α-奈酚，然后再與偶氮鹽偶聯(lián)，形成不溶性染料而呈現(xiàn)顏色。步驟：生長(zhǎng)胚胎干細(xì)胞克隆的蓋片以無(wú)水乙醇或冷丙酮固定10-15min→水洗→滴加孵育液室溫5-10min→水洗10min→復(fù)染（甲基綠等）10min。結(jié)果：未分化胚胎干細(xì)胞顏色以所用偶氮鹽品種而異，分化者則為復(fù)染液顏色。對(duì)照：以已建系ES細(xì)胞（或小鼠的脫帶桑椹胚或囊胚）作為陽(yáng)性對(duì)照，作用液中不含α-萘酚磷酸鈉為陰性對(duì)照。

職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)（4）胚胎干細(xì)胞特異表面抗原的表達(dá)免疫熒光檢測(cè)SSEA胚胎階段特異性抗原:SSEA-1SSEA-3SSEA-4

Thmoson分離的hES陰性弱陽(yáng)性強(qiáng)陽(yáng)性Gearhart分離的hES陽(yáng)性弱陽(yáng)性陽(yáng)性小鼠ES陽(yáng)性陰性陰性鼠和人胚胎干細(xì)胞表達(dá)的表面抗原有種屬差異。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)（4）胚胎干細(xì)胞特異表面抗原的表達(dá)RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的表達(dá)

Oct-4只限定在多潛能細(xì)胞中表達(dá)。人和小鼠的胚胎干細(xì)胞都表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4，當(dāng)胚胎干細(xì)胞分化時(shí)，其表達(dá)能力大大降低。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)（5）分化能力檢測(cè)體外分化能力觀察:無(wú)飼養(yǎng)層和無(wú)抑制分化因子的條件下培養(yǎng)，胚胎干細(xì)胞會(huì)分化成各種細(xì)胞或發(fā)育成胚胎體：3d“簡(jiǎn)單類胚體”

5-10d“囊狀胚體”

貼壁細(xì)胞為細(xì)胞分化物。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)體內(nèi)分化能力觀察：ES細(xì)胞接種同一品系小鼠腹股溝（107個(gè)細(xì)胞）或裸鼠、SCID小鼠（106個(gè)細(xì)胞）→約2周后出現(xiàn)腫塊，4-5周進(jìn)一步增大，摘除腫塊→固定切片染色：見(jiàn)三個(gè)胚層組織，為畸胎瘤結(jié)構(gòu)裸鼠和SCID小鼠可接種異種細(xì)胞和組織的移植也可接種腹腔，2-3周后觀察腫瘤職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)嵌合能力測(cè)定：野灰色小鼠品系（如129鼠）ES注射白化體小鼠（BALB/c小鼠）或純合非野灰色小鼠（C57BL/6小鼠）著床前胚胎內(nèi)，或?qū)?lái)源于白化體小鼠的ES注射野灰色小鼠或純合非野灰色小鼠著床前胚胎內(nèi)，再移植到假孕母鼠子宮內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體。如ES具有嵌合能力，則會(huì)融合到宿主胚胎細(xì)胞中，并共同發(fā)育形成各種組織細(xì)胞并產(chǎn)生個(gè)體小鼠即為嵌合體，其毛色應(yīng)是ES細(xì)胞來(lái)源品系小鼠和胚胎供體小鼠毛色的雜合，即有白色皮毛也有野灰色或黑色皮毛。除毛色觀察，也可檢測(cè)同工酶遺傳標(biāo)記，或采用PCR和小衛(wèi)星DNA方法等鑒定嵌合體。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)四、成體干細(xì)胞職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)成體干細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)獲取相對(duì)容易源于患者自身的成體干細(xì)胞在應(yīng)用時(shí)不存在組織相容性的問(wèn)題，避免了移植排斥反應(yīng)和使用免疫抑制劑理論上，成體干細(xì)胞致瘤風(fēng)險(xiǎn)很低，而且所受倫理學(xué)爭(zhēng)議較少成體干細(xì)胞還具有多向分化潛能職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)但胚胎干細(xì)胞也存在自身的優(yōu)勢(shì)：胚胎干細(xì)胞能永生化，可以傳代建系，且增殖能力強(qiáng)，來(lái)源充沛。雖然成體干細(xì)胞具有向多系分化的能力，但這種分化的“效率”尚不理想。通過(guò)體外的擴(kuò)增培養(yǎng)能提高轉(zhuǎn)化效率，但是體外的轉(zhuǎn)化是否會(huì)引起成體干細(xì)胞遺傳變化還有待證實(shí)，而且這種分化是否是成體干細(xì)胞多系分化的結(jié)果尚無(wú)法肯定。成體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞各有自身的優(yōu)勢(shì)和缺陷。同時(shí)開(kāi)展對(duì)兩者的研究，能互為裨益，相得益彰。兩者的研究對(duì)干細(xì)胞領(lǐng)域而言都是必要的。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)成體干細(xì)胞鑒定方法：科學(xué)家尚未就成體干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成一致，經(jīng)常被采用的鑒定方法包括：利用分子標(biāo)記在活體組織中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，然后確定它們所產(chǎn)生的特定細(xì)胞類型。將細(xì)胞從活體動(dòng)物上分離出來(lái)，在對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中進(jìn)行標(biāo)記，之后將細(xì)胞移植入另一個(gè)動(dòng)物體內(nèi)，觀察該細(xì)胞是否可以再生其來(lái)源組織。分離細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并對(duì)其分化進(jìn)行控制，通常采用加入生長(zhǎng)因子或向細(xì)胞內(nèi)引入新基因的方法，進(jìn)而觀察細(xì)胞的分化方向。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

目前研究的成體干細(xì)胞（AdultStemCells）骨髓造血干細(xì)胞(HSC)外周血干細(xì)胞(PBSC)胎肝干細(xì)胞臍血干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)造血干細(xì)胞作為干細(xì)胞研究與應(yīng)用的突破口1.造血細(xì)胞是細(xì)胞增殖分化的最佳模型。2.造血干／祖細(xì)胞及各系血細(xì)胞的表面標(biāo)志較為清楚，細(xì)胞表型特征可進(jìn)行定量分析，且可分選。3.造血干細(xì)胞增殖及向各系分化的重要誘導(dǎo)因子、受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、微環(huán)境等因素較為清楚。4.造血細(xì)胞發(fā)揮功能可相對(duì)游離，不需“生物支架”、神經(jīng)、血管、外科移植等復(fù)雜的“下游”工藝，因此便于直接應(yīng)用于臨床。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)神經(jīng)干細(xì)胞(nuralstemcell，NSC)

NSC可增殖分化出中樞神經(jīng)系統(tǒng)的三種基本細(xì)胞：神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞的生化標(biāo)記為巢素蛋白及波形蛋白。由于分離神經(jīng)干細(xì)胞所需的胎兒腦組織較難取材，神經(jīng)干細(xì)胞的研究仍處于初級(jí)階段。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)五、研究熱點(diǎn)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)五、目前干細(xì)胞的研究熱點(diǎn)人體干細(xì)胞的建株；干細(xì)胞保持不分化的培養(yǎng)；干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化；干細(xì)胞應(yīng)用的法律、倫理道德問(wèn)題；干細(xì)胞、組織工程、器官工程；胚胎組織的種植及定向誘導(dǎo)分化。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)六、應(yīng)用前景職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

六、胚胎干細(xì)胞研究的應(yīng)用前景ES細(xì)胞在哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)生發(fā)育規(guī)律的研究中極有價(jià)值的工具；ES細(xì)胞是研究細(xì)胞分化的理想手段；ES細(xì)胞是研究基因功能的首選細(xì)胞；ES細(xì)胞作為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要途徑之一；ES細(xì)胞治療技術(shù)將引起一場(chǎng)醫(yī)學(xué)革命；ES細(xì)胞可用于研究細(xì)胞癌變機(jī)理和新藥物的篩選。

HumanDiseasemodelHepatocytesBloodCells藥物開(kāi)發(fā)、毒性測(cè)試臨床醫(yī)療應(yīng)用基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究Humandiseasemodel胚胎干細(xì)胞的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研發(fā)與臨床應(yīng)用職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)來(lái)源于干細(xì)胞的組織可能用于治療的疾病

細(xì)胞類型 治療的疾病神經(jīng)細(xì)胞

中風(fēng)、帕金森氏病、老年癡呆癥、脊髓損傷、多發(fā)性硬化病心肌細(xì)胞 心臟病發(fā)作、充血性心臟病產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞糖尿病軟骨細(xì)胞 骨性關(guān)節(jié)炎血細(xì)胞

免疫缺乏癥、血液病、白血病肝細(xì)胞 肝炎、肝硬化皮膚細(xì)胞 燒傷骨細(xì)胞 骨質(zhì)疏松癥視網(wǎng)(眼)細(xì)胞 黃斑癥骨骼肌細(xì)胞肌肉萎縮癥職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)干細(xì)胞治療優(yōu)點(diǎn)明顯低毒性（或無(wú)毒性），一次藥有效；不需要完全了解疾病發(fā)病的確切機(jī)理；還可能應(yīng)用自身干細(xì)胞移植，避免產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。用干細(xì)胞治療疾病已不再只是設(shè)想。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)革命性的機(jī)制轉(zhuǎn)變利用胚胎干細(xì)胞治療疾病有廣泛的應(yīng)用前景，但是干細(xì)胞應(yīng)用在歐美卻受到社會(huì)倫理學(xué)的制約，并且在實(shí)際應(yīng)用中還不能避免免疫排斥。因此橫向分化的發(fā)現(xiàn)在干細(xì)胞研究中具有革命性意