DB63T-無漿體病防控技術(shù)規(guī)范

ICSFORMTEXT11.220FORMTEXTCCSB41FORMTEXTDBFORMTEXT63DBFORMTEXT63/TFORMTEXT××××—FORMTEXT××××FORMTEXTFORMTEXT無漿體病防控技術(shù)規(guī)范FORMTEXT點(diǎn)擊此處添加標(biāo)準(zhǔn)英文譯名FORMTEXT點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí)FORMDROPDOWNFORMTEXT（本稿完成日期：）FORMTEXT××××-FORMTEXT××-FORMTEXT××發(fā)布FORMTEXT××××-FORMTEXT××-FORMTEXT××實(shí)施FORMTEXT青海省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB63/T××××—××××I前??言本文件按照GB/T1.1一2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第Ⅰ部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由青海省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴德縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。本文件起草人：闞威、鄭思思、巨金玲、逯玉、蔡金山、張立成、游瀟倩、謝得軍、馬艷萍、蘇宏青、陶景蓮、曾占豪、李靜、林元清、馬金林、多杰才旦、陳峰、馬占軍、魏夢君、辛莉、孫生禎、李秀英、宋維芳。本文件由青海省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳監(jiān)督實(shí)施。無漿體病防控技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了無漿體病防控技術(shù)的術(shù)語和定義、病原、流行病學(xué)、臨床癥狀、病理剖檢變化、診斷和綜合防控等內(nèi)容。本文件適用于無漿體病的防控。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。無漿體無漿體（Anaplasma），隸屬于立克次體目（Rickettsiales）無漿體科（Anaplasmataceae）無漿體屬（Anaplasma），是通過蜱等吸血昆蟲傳播的一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生病原體，其主要寄生于羊、牛和鹿等動(dòng)物的血液細(xì)胞中。無漿體病無漿體?。ˋnaplasmosis）是由無漿體引起動(dòng)物的一種慢性和急性傳染病，其特征為發(fā)熱、貧血、黃疸、膽囊腫脹和進(jìn)行性消瘦。蜱傳病以寄生在動(dòng)物體表、吸取宿主血液的蜱蟲作為傳播媒介，將蜱蟲攜帶的致病性病原體通過叮咬易感動(dòng)物而是其感染相應(yīng)的疾病。病原無漿體無細(xì)胞壁，具多形性，如球形、環(huán)形、桿狀等，大小約0.3μm～1.0μm，革蘭氏（Gram）染色陰性，姬姆薩（Giemsa）染色呈紫紅色，在宿主紅細(xì)胞內(nèi)寄生時(shí)呈單個(gè)或多個(gè)存在，常位于紅細(xì)胞邊緣或中央。流行病學(xué)傳染源為感染無漿體的病畜。傳播途徑主要是通過媒介昆蟲叮咬動(dòng)物皮膚感染。媒介昆蟲主要是蜱，還包括牛虻、蠅和蚊等多種吸血昆蟲。被污染且消毒不徹底的手術(shù)器械、注射器、針頭等也可機(jī)械性傳播本病。羊、牛和鹿等動(dòng)物易感。幼畜易感性低，1歲以上動(dòng)物易感。該病有明顯的季節(jié)性，多在高溫季節(jié)發(fā)生。隨著蜱蟲的活躍暴發(fā)，6月份開始流行，8月～10月為流行高峰，11月份個(gè)別病例散在發(fā)生。臨床癥狀潛伏期為20d～30d。病畜體溫升高至40℃～42℃、衰弱無力、貧血、黃疸、萎頓、厭食、消瘦、尿液清亮常起泡沫等臨床癥狀。病理剖檢變化腹腔內(nèi)肝臟呈黃色，膽囊擴(kuò)張，膽汁充盈；脾臟腫大3倍～4倍，髓質(zhì)變脆如果醬；腸系膜淋巴結(jié)腫大、水腫；胃有出血性炎癥；腸道有卡他性炎癥。胸腔內(nèi)有少量滲出液；心臟腫大，心包積液，心冠狀脂肪和心肌出血，心內(nèi)外膜下和其他漿膜可見大量瘀斑；肺臟發(fā)生氣腫；頸部、胸下與腋下的皮下輕度水腫；血液稀薄。診斷初步診斷根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀、病理剖檢變化做出初步診斷。實(shí)驗(yàn)室診斷血液鏡檢采集可疑病畜靜脈血制作血涂片，姬姆薩染色紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)無漿體，對紅細(xì)胞的侵襲率超過0.5%時(shí)，做出陽性診斷。血液檢查發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞總數(shù)減少，血紅蛋白和紅細(xì)胞比容降低。分子生物學(xué)診斷樣本采集無菌抗凝管采集疑似患病畜血液1ml，4℃保存，立即送檢；采集蜱及病死畜實(shí)質(zhì)器官組織樣本，待檢備用。樣本運(yùn)輸和保存按照NY/T541執(zhí)行，對不立即檢測樣本可存于-20℃以下保存。樣本處理將蜱浸泡于75%酒精，15min，1倍磷酸鹽緩沖液或0.9%NaCl溶液洗3次，置于干凈的濾紙上吸水干燥，干燥后取同種蜱5只。無菌取黃豆大小的組織樣本（約50mg）。將以上樣本加入適量1倍Tris-EDTA緩沖液250μL研磨至勻漿狀，4℃保存?zhèn)溆?。血?200μL)無需處理可直接用于核酸提取。1倍磷酸鹽緩沖液、1倍Tris-EDTA緩沖液配置方法見附錄A。樣本DNA提取取上述樣本的勻漿液或血液樣本200μL加入200μLDNA提取液充分混勻，沸水浴8min(誤差不超過1min)，1200r/min離心10min，取上清作為模板備用?；虬凑丈唐坊⒘緿NA提取試劑盒說明書操作提取DNA，保存于-20℃?zhèn)溆?。DNA提取液配置方法見附錄A。PCR擴(kuò)增見附錄B。確診結(jié)合本文件8.1和8.2，做出確診。鑒別診斷應(yīng)與其他貧血癥、血液原蟲病相鑒別。綜合防控預(yù)防飼養(yǎng)管理提供優(yōu)質(zhì)飼料和充足的飲水。消毒滅蜱在蜱活躍季節(jié)，對畜群體表、圈舍及圈舍周圍環(huán)境定期進(jìn)行消毒滅蜱，消毒滅蜱方法見附錄C。調(diào)運(yùn)管理調(diào)運(yùn)動(dòng)物時(shí)應(yīng)對該病及其體表可能存在的傳播媒介進(jìn)行檢查，排除可疑病畜。治療病畜應(yīng)隔離治療，治療方法見附錄D。

（資料性附錄）

緩沖液配方及制法1倍磷酸鹽緩沖液取NaCl8g、KCl0.2g、NaHPO41.44g、KHPO40.24g放入燒杯中；向燒杯中加入約800ml的去離子水，用玻璃棒攪拌或使用磁力攪拌器攪拌，使藥品完全溶解；調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4；將溶液定容至1000ml后，高溫高壓滅菌，室溫保存，備用。1倍Tris-EDTA緩沖液取1MTris-HClBufferPH=8.0，5ml和0.5MEDTA，PH=8.0，1ml；向燒杯中加入約400mlddH2O均勻混合；將溶液定容到500ml后，高溫高壓滅菌，室溫保存，備用。DNA提取液配制提取液之前，先配制母液母液（滅菌）：1MTris-HCl(12.11gTris-HCl+ddH2O至100ml，用濃鹽酸調(diào)pH值至8.0；0.5MEDTA-Na2.2H2O(37.22g+ddH2O至200ml，用NaOH調(diào)pH值為8.0；5MNaCl(58.4g加ddH2O制成200ml溶液)。提取液配方配置100ml，需加入：CTAB粉劑2g，1MTris-HCl(pH8.0)10ml，0.5MEDTA(pH8.0)4ml，5MNaCl28ml，PVP1g，β-巰基乙醇1ml，加雙蒸水定容至100ml，備用。1倍Tris-乙酸-EDTA緩沖液先配制50倍Tris-乙酸-EDTA緩沖液，用時(shí)稀釋成1倍工作液。50倍Tris-乙酸-EDTA緩沖液的配制方法為：取Tris242g，EDTA-Na2.2H2O37.2g，加入約600mL的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?，再加?7.1mL的醋酸，充分?jǐn)嚢?，加去離子水將溶液定容至1L后，室溫保存；1倍Tris-乙酸-EDTA緩沖液，取50倍Tris-乙酸-EDTA緩沖液20ml，加ddH2O定容至1L，備用。

（資料性附錄）

PCR擴(kuò)增擴(kuò)增方法采用普通PCR擴(kuò)增，用無漿體屬特異性基因rpoB（RNA聚合酶β亞基）進(jìn)行鑒定，試驗(yàn)所用引物、反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序如下：無漿體屬特異性基因rpoB引物序列：見表B.1；引物濃度均配制成10μmol/L；PCR反應(yīng)體系，見表B.2；PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性15min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，反應(yīng)中設(shè)立陰性對照、陽性對照和空白對照。無漿體擴(kuò)增引物名稱靶基因引物名稱5′-3′序列退火溫度片段大小無漿體屬rpoBgeneAna-rpoBFGCTGTTCCTAGGCTYTCTTACGCGA58℃525bpAna-rpoBRAATCRAGCCAVGAGCCCCTRTAWGG注：R、V、W，為兼并堿基，R=A/G，V=A/G/C，W=A/T。PCR反應(yīng)體系組分1個(gè)擴(kuò)增體系加入量2×PCRmix12.5μL上游引物1μL下游引物1μL模板2μL無菌無核酸酶水8.5μL總體系25μL電泳制備1%瓊脂糖凝膠，將核酸擴(kuò)增產(chǎn)物及DNAMaker加入膠孔，將凝膠放入電泳槽中，加入足量的1倍Tris-乙酸-EDTA緩沖液，使凝膠完全浸沒，接通電源，電壓為120V～150V，電泳時(shí)間30min～40min。1倍Tris-乙酸-EDTA緩沖液配置方法見附錄A。結(jié)果判定陰性對照、空白對照未出現(xiàn)條帶，陽性對照在525bp有擴(kuò)增條帶，即試驗(yàn)成立。如待檢樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，則判定該檢測樣本的PCR檢測結(jié)果為陰性；如待檢樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測出現(xiàn)525bp的擴(kuò)增條帶，則判定該檢測樣本的PCR檢測結(jié)果為陽性，見圖B.1。無漿體病靶基因rpoBPCR擴(kuò)增圖注：M—DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Trans2000；1—陽性對照（牛邊緣無漿體（臨洮株））；2—陽性樣本（羊全血無漿體測序陽性）；3—陰性對照（生理鹽水）；4—空白對照。

（資料性附錄）

消毒滅蜱表C.1給出了消毒滅蜱方法。消毒滅蜱方法藥物名稱消毒區(qū)域消毒方法用法用量0.05%辛硫磷混懸液圈舍噴灑1周～2周消毒一次1%敵百蟲溶液動(dòng)物體表噴灑1周～2周消毒一次

（資料性附錄）

治療藥物及方法表D.1給出了治療藥物及方法。治療藥物及方法防控方法藥物名稱給藥途徑給藥劑量使用方法注意事項(xiàng)治療土霉素口服或肌注每公斤體重10mg連用12d～16d/金霉素口服或肌注每公斤體重15mg連用12d～16d/25%葡萄糖＋維生素C注射液／內(nèi)服氯氰碘柳胺鈉和阿維菌素合劑靜脈注射+內(nèi)服羊劑量：25%葡萄糖150ml5%維生素C注射液4ml（牛劑量為羊的3倍）；合劑氯氰碘柳胺鈉和阿維菌素內(nèi)服（每1kg體重，牛、羊0.1片）。靜脈注2次/d，連用3d，待患畜精神好轉(zhuǎn)，食欲恢復(fù)后用合劑（氯氰碘柳胺鈉和阿維菌素）1次，2周后，再用合劑（氯氰碘柳胺鈉和阿維菌素）1次。合劑氯氰碘柳胺鈉和阿維菌素，每片含氯氰碘柳胺鈉50mg，阿維菌素3mg。驅(qū)蟲對同群動(dòng)物用阿苯達(dá)唑伊維菌素片，每10kg體重，0.27g～0.36g灌服，同時(shí)用螨凈溶液噴灑動(dòng)物體表和圈舍。參?考?文?獻(xiàn)[1]Dahmani,M.,Davoust,B.,Rousseau,F.,Raoult,D.,Fenollar,F.,Mediannikov,O.,2017.NaturalAnaplasmataceaeinfectioninRhipicephalusbursatickscollectedfromsheepintheFrenchBasqueCountry.TicksTick.Borne.Dis.8,18–24.[2]He,Y.,Chen,W.,Ma,P.,Wei,Y.,Li,R.,Chen,Z.,Tian,S.,Qi,T.,Yang,J.,Sun,Y.,Li,J.,Kang,M.,&Li,Y.(2021).Moleculardetectiono