菌種管理規(guī)范操作手冊

檢定菌保留、傳代、使用、銷毀原則操作規(guī)程

1.目日勺：

規(guī)范藥物微生物學檢定用菌口勺管理，最大程度減少變異率，保證菌種

的溯源性與穩(wěn)定性，從而保證微生物學檢查成果的精確可靠。

2.根據(jù)：ChP2023版（一部）、《中國藥物檢查原則操作規(guī)范》（2023

年版）。

3.范圍：

本規(guī)程合用于檢定用菌種H勺管理，包括菌種日勺申購、保留、傳代、使

用及銷毀等。

4.責任：

主管負責菌種的申購、接受、保留、分發(fā)。

42微生物檢查員負責菌種確實認、傳代、使用及銷毀。

5.有關(guān)文獻及術(shù)語：

5.1.術(shù)語

原則菌種是指由中國藥物生物制品檢定所醫(yī)學微生物菌種保藏管理

中心提供的冷凍干燥菌。

傳代用菌種是指用原則菌種制備的采用特定保留措施長期固定保留

的菌種，用于傳代及制備工作用菌種。

工作用菌種是指用原則菌種或傳代用菌種接種至一般瓊脂斜面培養(yǎng)

后，作為平常工作使用時菌種。

菌種時代是指將其接和至一新鮮培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基內(nèi)，每萌發(fā)一次即

稱為一代，從菌種保藏中心獲得日勺冷凍干燥菌種為第0代。

6.原則：

6.1.檢定菌H勺申購

QC主管每年根據(jù)檢定菌種的使用狀況（包括臨時檢查需要），提出購

置計劃，交由質(zhì)量管理部部長審批后，向中檢所菌種保藏中心或?。ㄊ校?/p>

藥檢所購置凍干菌種1原則菌種）；也可以直接向省（市）藥檢所購

置傳代用菌種，購置時，需問詢與確定菌種H勺代數(shù)，以便傳代時控制

代數(shù)。

6.2.檢定菌口勺接受

菌種抵達試驗室后，由QC主管接受菌種，檢查其名稱和數(shù)量，以及

每一支的完整性，同步將菌種口勺所有信息，填寫在《檢定菌接受記錄》

（附表1）上，內(nèi)容包括：名稱、數(shù)量、編號（無編號者按檢定菌種

的編號原則編號）、代數(shù)、來源、接受日期、接受人等，并將其暫貯

存于4?8c冰箱中，在一周內(nèi)必須完畢轉(zhuǎn)種。

6.3.檢定菌日勺保留

.工作用菌種的保留工作用菌種采用斜面低溫保留法。

將菌種接種在合適H勺固體斜面培養(yǎng)基上，待菌生長充足后來，轉(zhuǎn)移至

4?8c冰箱中保留。此法僅用于工作用菌種的短期保留，并應隨時檢

查其污染雜菌和變異等狀況，發(fā)現(xiàn)異常狀況，經(jīng)應滅活處理后銷毀。

保留時間根據(jù)菌種種類而不一樣，細菌：1個月；酵母菌：2個月；

霉菌及芽胞：3個月。

,傳代用菌種的保留

采用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟保留法。.甘油冷凍管保留法用無

菌接種環(huán)輕輕刮取經(jīng)冷凍身溶增菌后并接種至平板或瓊脂斜面的菌

苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間口勺輕輕摩擦而使細菌充足擴散到預先

裝入試管中的J無菌純化水中，調(diào)整菌液濃度，使其等同于10號比濁

管，向已制備好的菌懸液中加入等體積的無菌甘油（濃度20%）,即

為10%甘油菌懸液，輕輕振搖，使內(nèi)容物充足混合，分裝于無菌小試

管，在冷凍條件下保留。此甘油冷凍管為第代（）可以每

-30C2G2o

隔2年轉(zhuǎn)種一代。使用時;取出一支放至室溫，轉(zhuǎn)種增菌培養(yǎng)或接種

至瓊脂斜面第蘇，挑取純菌落傳代或工作用。

此種措施重要合用于需氧細菌和酵母菌的保臧（如大腸埃希菌、金黃

色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌）。

.液體石蠟保留法

.無菌液體石蠟的制備：選用優(yōu)質(zhì)化學純液體石蠟，將液體石蠟分裝

加塞，用牛皮紙包好，在121C滅菌30分鐘，置40℃恒溫箱中蒸發(fā)水

分，經(jīng)無菌檢查后備用。

.液體石蠟管H勺制備：將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中，在合

適條件下培養(yǎng)結(jié)束后，在層流臺下用無菌吸管吸取上述無菌液體石蠟

至培養(yǎng)好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1cm使菌體與空氣

隔絕，并將試管直立，置于-20C冷凍或2?8℃冰箱中保留。

此法重要合用于霉菌、厭氧菌、放線菌、芽抱桿菌口勺保留（如枯草芽

電桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。

.各菌種的保留措施、條件及期限，見《傳代用菌種保留措施、保留

溫度、保留期限》（附件1）

6.4.檢定菌日勺傳代

檢定菌菌種H勺傳代因凍干菌（原則菌種）與傳代用菌種而不完全相

似。

.原則菌種的復蘇、確認、傳代

.原則菌種的復蘇

.把凍干菌種管、滅菌毛細滴管（1ml）、雙碟、鏡子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)

基（或其他合適培養(yǎng)基）數(shù)支，移入接種室或超凈工作臺。

?將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦凈，放

在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點燃酒精燈，將原則菌種管的J封口一端在火焰

上，燒灼紅熱，用滅菌毛細滴管吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其他合適的

培養(yǎng)基），滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。

.取滅菌錦子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內(nèi)，另

取1支滅菌毛細滴管，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其他合適H勺

培養(yǎng)基）少許，加至菌種管底部，將凍干菌塊攪動促使溶解，隨即吸

出管內(nèi)菌液，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其他合適口勺培養(yǎng)基）內(nèi)，并

根據(jù)不一樣菌種類型而將其培養(yǎng)于相宜的溫度下24?72小時（細菌

需要24?48的培養(yǎng)物，酵母菌需要72小時口勺培養(yǎng)物，形成抱子口勺微

生物則宜保臧孑包子，放線菌和絲狀真菌則應培養(yǎng)7?10天）。最終將

毛細滴管及菌種管經(jīng)高溫滅菌（121℃,45分鐘）。

.取出培養(yǎng)物，仔細觀測液體培養(yǎng)基與否渾濁，渾濁闡明菌種復活生

長，若不渾濁，在將其作為無活菌生長的培養(yǎng)物丟棄此前，細菌應至

少培養(yǎng)1周以上，真菌和酵母菌至少應培養(yǎng)2周以上，并在丟棄之前

應高溫滅活處理（121℃,45分鐘）。

.原則菌種確實認

.用無菌接種環(huán)取上述培養(yǎng)物接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（細菌）或玫瑰

紅鈉培養(yǎng)基（真菌和酵母菌）平板上，或?qū)囊擞谠摼LU勺鑒別

培養(yǎng)基平板上，然后在30?35℃下培養(yǎng)3天（細菌）；20?25℃下培

養(yǎng)5天（真菌和酵母菌）。培養(yǎng)后，首先觀測其與否具有經(jīng)典的菌落

形態(tài)，然后挑取生長旺盛的單一的純菌落，劃線于平皿培養(yǎng)基，每種

菌劃4個平皿，以便搜集較多的生長旺盛日勺經(jīng)典單菌落，進行保留和

鑒定。鑒定期作革蘭氏染色、鏡檢，觀測其染色特性及形態(tài)特性。最

終再做生化試驗以深入鑒定該菌種。

若在該平板上發(fā)既有其他菌落生長，則闡明操作有污染或菌種不純,

應將此被污染了日勺培養(yǎng)物滅活處理」并尋找原因。應根據(jù)其原因采用

措施重新分離挑選純菌落。

.菌種確實認成果，記錄在《檢定菌種鑒定記錄》上。

.各檢定菌種口勺復活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件，見《菌種復活、劃

線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件》（附件2）。

.原則菌種的傳代

.按菌種闡明書規(guī)定復溶菌粉，轉(zhuǎn)種于合適的增菌培養(yǎng)基內(nèi)，稱第1

代（G1）,復壯后轉(zhuǎn)接至平板上，并在合適溫度下培養(yǎng)合適時間，分

離單個純種菌落，此為第2代（G2）。

.菌種確認后，挑取平板上純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管,

作為保留菌種（G2）,也稱傳代用菌種，同步挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌

種數(shù)支，作為工作用菌種，此為第3代（W3）。

.將第2代（G2）菌種管冷凍保留，將工作用菌（W3）于合適溫度

下培養(yǎng)合適時間后用于平常檢查。

.取一支冷凍保留H勺第2代（G2）菌種轉(zhuǎn)種于平板和斜面培養(yǎng)基上,

平板上的菌種制成冷凍保留管第3代（G3）；斜面培養(yǎng)基的菌種經(jīng)合

適溫度下培養(yǎng)合適時間后用作工作用菌種，此仍為第3代（W3）。

.將第3代菌種（G3）冷凍或低溫保留，將生長、轉(zhuǎn)種后的第2代（G2）

菌種經(jīng)高溫滅活處理后丟棄。

.按上述規(guī)程操作，直至G4轉(zhuǎn)為W5為止，需重新啟動冷凍干燥菌

種，反復上述規(guī)程操作，保留和使用菌種。

.當工作用菌種代數(shù)不大于5時，在規(guī)定保留期限內(nèi)，可直接用上一

代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種。

,傳代用菌種的傳代

當無原則用菌種時，可從省（市）藥檢所購置菌種作為傳代用菌種,

不需通過笑溶增菌，但應劃線接種確認。

將購回無異常的傳代用菌種（一般為第3代），根據(jù)平常檢查工作H勺

需要量,挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種數(shù)支，作為工作用菌種（為第4代），

同步，結(jié)合菌種H勺代數(shù)和最長保留期限，挑取純菌落制成濃菌懸液按

的措施制備甘油冷凍管或液體石蠟管數(shù)支，作為傳代用菌種（仍

為第3代）。

.工作用菌種的傳代

當工作用菌種代數(shù)不大于5時，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一

代工作用菌種。取在冰箱4?8℃保留的工作用菌種用一般瓊脂斜面

傳代，并將新傳代的培養(yǎng)物替代原有的菌種，作為工作用菌種。也

可取用“甘油冷凍管保藏法或液體石蠟覆蓋保藏法”保留的菌種，進

行復蘇，直接作為工作用菌種。細菌每1個月傳代一次；酵母菌每2

個月傳代一次；霉菌及芽胞每3個月傳代一次。當超過5代，須用傳

代用菌種傳代。

.傳代時注意無菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丟失。同步試驗

人員也要采用有效日勺防止措施進行自我保護，如工作時必須穿工作服,

佩帶無菌手套，試驗完畢后來消毒試驗進行［］勺區(qū)域、試驗儀器和器具。

如發(fā)生意外，如菌種泄漏或人員受傷，微生物學檢查人員應立即向

QC主管匯報以便及時進行處理。

.傳代后，按檢定菌種的編號原則編號，并在每一支菌種管上貼上標

簽，標簽內(nèi)容包括：名稱、編號、代數(shù)、傳代日期、操作人、有效期。

交QC主管統(tǒng)一保管。同步及時填寫《菌種傳代、分離記錄》（附表2）。

6.5.檢定菌種日勺編號

采用字母加數(shù)字表達：英文縮寫字母一代次一傳代日期一次序號菌

種時英文縮寫字母：大腸埃希菌（E.c）、金黃色葡萄球菌（S.a）、枯

草芽抱桿菌（B.s）、白色念珠菌（C.a）、黑曲霉菌（A.n）、乙型副傷

寒沙門菌（S.p）

代數(shù)用一位帶有下標數(shù)字U勺字母表達：傳代用菌種用G表達；工作用

菌種用W表達；如G3表達傳代用菌種笫3代；W3表達工作用菌種

第3代。傳代日期用6位數(shù)字表達：年份取最終兩位數(shù)，月、日分

別用兩位數(shù)。如2023年1月12日傳代的第一支大腸埃希菌作為傳

代用菌種的編號為：E.C-G3—Olo

6.6.檢定菌種口勺保管

.檢定菌種設專人加雙鎖保管，并對所保留H勺菌種建立《檢定菌種保

留、領(lǐng)用登記臺賬》（附表3）。

.檢定菌種時定期檢查與鑒定

在菌種的保留期間，應每天檢查保留菌種冰箱口勺溫度、菌種管的塞子

與否松動或生霉，并及時填寫《檢定菌種觀測記錄》（附表4）,如有

異常應及時處理。菌種在保留期內(nèi)均應根據(jù)菌種的特性（工作用菌

種每轉(zhuǎn)種兩代一次、傳代用菌種每三個月一次）檢查其菌落性狀、革

蘭染色、顯微鏡下菌體形態(tài)及生化特性等項目，若發(fā)現(xiàn)與原菌種變異

較大，應重新分離、純化、鑒定、再加以保留，并做好《檢定菌種鑒

定記錄》（附表5）。

.所保管H勺菌種，不能隨意轉(zhuǎn)讓其他單位和個人，需要時應有單位證

明和同意手續(xù)方可供應。

6.7.檢定菌種口勺領(lǐng)用與使用

?微生物學檢查人員根據(jù)檢查需要，需到QC主管領(lǐng)取工作用菌種或

傳代用菌種，同步填寫《檢定菌種領(lǐng)用登記臺賬》有關(guān)內(nèi)容。

?微生物學檢查人員從QC主管領(lǐng)取工作用菌種或傳代用菌種，用于

平常檢查或驗證試驗，使用后及時填寫《檢定菌種使用登記臺賬》（附

表6）,以便追蹤菌種使用歷史。

6.8.檢定菌種（廢棄）的銷毀

.下列狀況的菌種或培養(yǎng)物或被污染口勺器具等，必須采用121℃、45

分鐘濕熱滅活處理：新一代菌種制備成功后的上一代菌種；

使用完后的菌種和帶有原則菌種H勺器具和培養(yǎng)物；超過有效期H勺菌

種；凡被污染、變異、可疑等異常狀況菌種；其他應廢棄的菌種。

.廢棄菌種的銷毀由QC主辦提出申請，交QC主管同意后，由微生

物學檢查員進行滅活處理」并有其他人在場監(jiān)督，并填寫《廢棄菌種

（物品）銷毀處理記錄》（附表7）。

7.記錄歸檔

本原則波及的記錄由質(zhì)量管理部保留，保留期5年。

8.附則：木原則附件二份，附表六份：

附件1：《傳代用菌種保留措施、保留溫度、保留期限》

附件2：《菌種復活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件》

附表1：《檢定菌接受記錄》

附表2：《檢定菌種傳代、分離記錄》

附表3：《檢定菌種保留、領(lǐng)用登記臺賬》

附表4：《檢定菌種觀測記錄》

附表5：《檢定菌種鑒定記錄》

附表6：《檢定菌種使用登記臺賬》

附表7：《廢棄菌種（物品）銷毀處理記錄》

附件1：傳代用菌種保留措施、保留溫度、保留期限菌種名稱

菌種名稱保留措施保留溫度保留期限

大腸埃希菌（CMCqB）44102）甘油冷凍管-30℃2年

金黃色葡萄球菌（CMCC（B）26003）甘油冷凍管-30℃2年

枯草芽抱桿菌(CMCC(B)63501)液體石蠟管2-8℃1年

白色念珠菌(CMCC(F)98001)液體石蠟管2-8℃1年

黑曲霉菌(CMCC(F)98003液體石蠟管2-8℃1年

乙型副傷寒沙門菌(CMCC(B)50094)