DB36T-飼料及飼料原料中赭曲霉毒素A的快速篩查-膠體金快速定量法

ICS?FORMTEXT點(diǎn)擊此處添加ICS號FORMTEXT點(diǎn)擊此處添加中國標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號FORMTEXT?????DBFORMTEXT36DBFORMTEXT36/FORMTEXTTXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXT?????FORMTEXT飼料及飼料原料中赭曲霉毒素A的快速篩查膠體金快速定量法FORMTEXTScreeningofOchratoxinAinAnimalFeedingStuffs——RapidQuantitativeMethodofColloidalGoldTechniqueFORMTEXT點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識FORMDROPDOWNFORMTEXT?????FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實施FORMTEXT?????江西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局???發(fā)布DB36/TXXX—XXXX前??言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13原理 14試劑和材料 15儀器和設(shè)備 16試樣制備與保存 27分析步驟 28結(jié)果表述 29重復(fù)性 3附錄A（資料性附錄）膠體金免疫層析快速篩查組件試劑配制與技術(shù)要求 4前??言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由江西省飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江西省獸藥飼料監(jiān)察所、中檢環(huán)貿(mào)生物技術(shù)（北京）有限公司、雙胞胎（集團(tuán)）股份有限公司、江西正邦科技股份有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：楊琳芬、符金華、李瑾瑾、李華、廖豐、劉世寧、董澤民、劉國花、黃艷清。飼料及飼料原料中赭曲霉毒素A的快速篩查膠體金快速定量法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用膠體金免疫層析法快速篩查測定飼料及飼料原料中赭曲霉毒素A，為定量篩查方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于小麥、大米、黃豆、玉米、豆粕、花生粕、DDGS等原料及飼料中赭曲霉毒素A的快速定量篩查。定量檢測限為1μg/kg(ppb)，檢測范圍為1μg/kg(ppb)-20μg/kg(ppb)。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T20195動物飼料試樣的制備GB/T27404實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測原理本方法應(yīng)用了免疫層析原理。試樣提取液中的赭曲霉毒素A與檢測條中膠體金微粒發(fā)生反應(yīng)，赭曲霉毒素A與膠體金微粒的結(jié)合物以及膠體金微粒在側(cè)流作用下移動，當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測線時，檢測上包被的抗原與膠體金微粒結(jié)合發(fā)生呈色反應(yīng)，顏色深淺與試樣中赭曲霉毒素A含量相關(guān)。用讀數(shù)儀測定檢測條上檢測線和質(zhì)控線顏色深淺，根據(jù)顏色深淺和讀數(shù)儀內(nèi)置曲線計算出試樣中赭曲霉毒素A含量。試劑和材料除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合GB/T6682二級水的規(guī)定。膠體金免疫層析快速篩查組件（參見附錄A）。赭曲霉毒素A檢測試紙條：符合附錄A規(guī)定的檢測條產(chǎn)品，技術(shù)要求參考GB/T27404，按說明書要求冷藏保存。稀釋緩沖液：與膠體金檢測條配套提供，或按照其說明書配制。提取液：70%（v/v）甲醇溶液或膠體金檢測條配套的提取液。儀器和設(shè)備天平:分度值0.01g。粉碎機(jī)：可使試樣粉碎后全部通過20目篩。離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于4000r/min。渦旋振蕩器。孵育器：可調(diào)節(jié)時間、溫度,控溫精度±1℃。讀數(shù)儀：可測定并顯示膠體金定量檢測條的測定結(jié)果。聚苯乙烯離心管：50mL。試樣制備與保存試樣制備按GB/T20195要求制備試樣。試樣保存將試樣于-10℃～-20℃下避光保存。分析步驟樣品提取取有代表性的樣品500g，粉碎機(jī)（5.2）粉碎至全部通過20目篩,混勻。準(zhǔn)確稱取10.00g試樣于100mL具塞錐形瓶中，加入20.0mL試樣提取液（4.2），密閉，用渦旋振蕩器（5.4）振蕩1min～2min，靜置后用濾紙過濾，或取1mL～1.5mL混合液于離心管中，用離心機(jī)（4000r/min）（5.3）離心1min。取濾液或離心后上清液100μL于另一離心管中，加入1.0mL稀釋緩沖液（4.1.2），充分混勻待測。不同廠家的赭曲霉毒素A膠體金快速定量條所用的樣品制備方法不同，如提供赭曲霉毒素A膠體金快速定量檢測條使用說明，則按照使用說明中規(guī)定的方法進(jìn)行操作。樣品測定將膠體金檢測條（4.1.1）從冷藏狀態(tài)（2℃-8℃）取出放置至室溫。將孵育器（5.5）預(yù)熱至孵育溫度45℃。將檢測條（5.7）平放在孵育器（5.5）凹槽中，打開加樣槽。準(zhǔn)確移取300μL待測溶液（7.1.2），加入檢測條加樣孔中，關(guān)閉孵育器（5.5）蓋。孵育5min后，取出檢測條（4.1.1）觀察質(zhì)控線和檢測線顯色情況，必須出現(xiàn)清晰齊整的質(zhì)控線即C線。若出現(xiàn)下述情況，視為檢測條無效：C線（質(zhì)控線）不出現(xiàn)、彌散或嚴(yán)重不均勻；T1或T2線（檢測線）嚴(yán)重不均勻；待測溶液掩蓋或模糊了T1、T2線或C線；膠體金顯色微粒沒有通過T1、T2線或C線。無效的檢測條（4.1.1）不要放入讀數(shù)儀（5.6）進(jìn)行測定。選取讀數(shù)儀（5.6）赭曲霉毒素A檢測頻道中“基質(zhì)00”（MATRIX00）樣品測定類型進(jìn)行測定，測定需在2min內(nèi)完成，讀數(shù)儀（5.6）顯示樣品中赭曲霉毒素A的含量。若讀數(shù)儀（5.6）顯示“12+”，需將樣品稀釋后，讀數(shù)儀（5.6）設(shè)定為“基質(zhì)01”（MATRIX01）樣品測定類型重新進(jìn)行測定。稀釋方法為：移取300μL稀釋提取液（7.1.2）于離心管中，加入1.0mL稀釋緩沖液后混勻，按7.2.1-7.2.4重新測定。結(jié)果表述赭曲霉毒素A含量以微克每千克（μg/kg等同于ppb）表示，由讀數(shù)儀直接顯示和讀取。重復(fù)性在同一實驗室，由同一操作者使用相同儀器，按相同的測定方法，并在短時間內(nèi)對同一被測試對象相互獨(dú)立進(jìn)行測試獲得的兩次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對差值大于算術(shù)平均值20%的情況不超過5%。

（資料性附錄）

膠體金免疫層析快速篩查組件試劑配制與技術(shù)要求樣本稀釋液配制（根據(jù)說明書重新添加）磷酸二氫鉀0.2g十二水合磷酸氫二鈉2.9g氯化鈉8.0g氯化鉀0.2gTritonX-1000.5mL加水定容至1000mL。基本要求工作環(huán)境要求氣溫：23℃～25℃?？乖篝髑苟舅谹半抗原與載體蛋白進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，能夠達(dá)到包被要求?？贵w要求用赭曲霉毒素A抗原免疫小鼠，制備針對赭曲霉毒素A的特異性單克隆抗體，能夠達(dá)到檢測要求。原材料要求樣品墊：玻璃纖維或無紡布。金釋放墊：玻璃纖維片，免疫金釋放時間小于10min，釋放效率大于90%。反應(yīng)膜：硝酸纖維素膜，孔徑為0.45μm，4cm浸潤時間不小于140s。吸水紙。塑料卡盒：丙烯腈、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物。性能要求準(zhǔn)確度采用5μg/kg（5ppb）、10μg/kg（10ppb）和20μg/kg（20ppb）三個濃度水平的陽性樣品，每個濃度水平測定不低于6次，通過偏差來表達(dá)，3個濃度水平的偏差均應(yīng)控制在-20%～+20%之間。精密度采用5μg/kg（5ppb）濃度水平的實際樣品，測定不低于6次，通過批內(nèi)變異系數(shù)來表達(dá)，變異系數(shù)應(yīng)≤20%。檢測限計算20份陰性樣品測定均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差，其結(jié)果應(yīng)小于或等于產(chǎn)品靈敏度標(biāo)示值。批間穩(wěn)定性采用5μg/kg（