流行性感冒病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料指導(dǎo)原則

流行性感冒病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料指導(dǎo)原則對(duì)流感病毒核酸檢測(cè)試劑的一般要求01一、前言三、注冊(cè)申報(bào)資料要求五、參考文獻(xiàn)二、適用范圍四、名詞解釋目錄03050204基本信息《流行性感冒病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料指導(dǎo)原則》是對(duì)流感病毒核酸檢測(cè)試劑的一般要求。一、前言一、前言本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)流行性感冒病毒（以下簡(jiǎn)稱流感病毒）核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。本指導(dǎo)原則是對(duì)流感病毒核酸檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。二、適用范圍二、適用范圍流感病毒核酸檢測(cè)試劑是指利用熒光探針聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）或其他類分子生物學(xué)方法，以特定的流感病毒基因序列為檢測(cè)目標(biāo)，對(duì)人咽拭子、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物樣本中的流感病毒進(jìn)行體外定性檢測(cè)的試劑。本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。三、注冊(cè)申報(bào)資料要求（一）綜述資料（二）產(chǎn)品說明書（三）擬定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)及編制說明（四）注冊(cè)檢測(cè)（五）主要原材料研究資料（六）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料010302040506三、注冊(cè)申報(bào)資料要求（七）分析性能評(píng)估資料（八）參考值（參考范圍）確定資料（九）穩(wěn)定性研究資料（十）臨床試驗(yàn)研究三、注冊(cè)申報(bào)資料要求（一）綜述資料流感病毒包括甲、乙、丙三型，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型極少引起流行。依據(jù)病毒顆粒外膜血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分為16個(gè)H亞型（H1-H16）和9個(gè)N亞型（N1-N9），目前已有H1、H2、H3、H5、H7和H9等亞型有人感染的報(bào)道。由于編碼HA和（或）NA的核苷酸序列容易發(fā)生突變，致使HA和（或）NA的抗原表位發(fā)生改變，這種抗原性的改變使人群原有的特異性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起較大規(guī)模甚至世界性的流感流行。按照流行特點(diǎn)，造成人間流感流行的流感病毒可區(qū)分為季節(jié)性流感病毒和新型甲型流感病毒。季節(jié)性流感病毒通常在年度間發(fā)生小范圍的基因變異，這種基因變異會(huì)導(dǎo)致微小的抗原性改變，稱為抗原漂移（antigenicdrift）。因此，季節(jié)性流感病毒雖具有年度特異性且抗原性的改變使感染者不易獲得持久免疫力，但傳播范圍通常局限于較小的人群范圍，一般不會(huì)造成太高的發(fā)病率和死亡率，易感人群多為老年人（>65歲）和嬰幼兒（<6歲）。在過去的幾十年中，季節(jié)性流感病毒主要集中在甲型H3N2和H1N1亞型。近年來(lái)，新型甲型流感病毒亞型暴發(fā)流行的案例時(shí)有發(fā)生。例如，2009年新型甲型H1N1流感病毒造成全球性流感大流行；人感染高致病性禽流感（H5亞型）病毒的病例時(shí)有報(bào)道，禽類甲型H5N1亞型流感病毒被認(rèn)為具有造成人間大范圍流感流行的潛力。新型甲型流感病毒通常由于基因的節(jié)段性重組所致，這種大范圍的基因改變易導(dǎo)致病毒抗原特性的重大改變，稱為抗原轉(zhuǎn)變（antigenicshift）。新型甲型H1N1流感病毒（2009）即同時(shí)包含了禽流感、豬流感和人季節(jié)性流感的基因片段從而導(dǎo)致病毒在抗原水平發(fā)生了明顯改變。由于抗原性的明顯改變以及可能由此造成的病毒毒力的增強(qiáng)，病毒的傳染性和致病嚴(yán)重程度都有所增加，故新型甲型流感病毒可能造成更高的發(fā)病率和死亡率。（二）產(chǎn)品說明書說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標(biāo)本采集及處理、實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)結(jié)果解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說明書是體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，下面對(duì)流感病毒核酸檢測(cè)試劑說明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明，以指導(dǎo)注冊(cè)申報(bào)人員更合理地完成說明書編制。1.【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：（1）試劑盒用于定性檢測(cè)人鼻咽拭子、口咽拭子、呼吸道抽吸液、洗液和/或其他呼吸道分泌物樣本的流感病毒核酸，適用樣本類型應(yīng)結(jié)合實(shí)際的臨床研究完成情況進(jìn)行確認(rèn)。（2）簡(jiǎn)單介紹待測(cè)目標(biāo)的特征，如病毒種系淵源、生物學(xué)性狀、宿主特性、致病性、感染后臨床表現(xiàn)、待測(cè)靶基因特征等。（三）擬定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)及編制說明擬定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合《辦法》和《體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料基本要求》的相關(guān)規(guī)定。另外，對(duì)于國(guó)產(chǎn)試劑，應(yīng)參考《中國(guó)生物制品規(guī)程》（2000年版），將擬申報(bào)產(chǎn)品的主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定等內(nèi)容作為附錄附于標(biāo)準(zhǔn)正文后，并在正文的“產(chǎn)品分類”項(xiàng)中引出該附錄內(nèi)容。附錄中應(yīng)將待測(cè)靶基因的基因位點(diǎn)、全序列，引物/探針序列、來(lái)源及驗(yàn)證情況，各種酶的來(lái)源、特性以及驗(yàn)證等重點(diǎn)內(nèi)容予以明確。流感病毒核酸檢測(cè)試劑的注冊(cè)檢測(cè)應(yīng)主要包括以下性能指標(biāo)：物理性狀、試劑盒內(nèi)陰性/陽(yáng)性對(duì)照品（質(zhì)控品）的Ct值要求（包括內(nèi)標(biāo)）、陽(yáng)性/陰性參考品符合率、精密度、最低檢測(cè)限（分析靈敏度）等。陽(yáng)性參考品主要考察對(duì)不同來(lái)源的病毒株、不同滴度的檢測(cè)符合性，對(duì)于甲型流感病毒核酸通用型檢測(cè)試劑，在此還應(yīng)考慮不同亞型的覆蓋檢測(cè)能力。陰性參考品則是對(duì)分析特異性（交叉反應(yīng)）的驗(yàn)證，應(yīng)主要包括易發(fā)生交叉反應(yīng)的其他病原體的假陽(yáng)性情況的考核。如果擬申報(bào)試劑已有相應(yīng)的國(guó)家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，則企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求不得低于上述標(biāo)準(zhǔn)要求。（四）注冊(cè)檢測(cè)根據(jù)《辦法》要求，首次申請(qǐng)注冊(cè)的第三類產(chǎn)品應(yīng)該在國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)可的、具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)3個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊(cè)檢測(cè)。對(duì)于已經(jīng)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的流感病毒項(xiàng)目，在注冊(cè)檢測(cè)時(shí)應(yīng)采用相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行,對(duì)于目前尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的項(xiàng)目，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立自己的參考品體系并提供相應(yīng)的內(nèi)部參考品。（五）主要原材料研究資料應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品或標(biāo)準(zhǔn)品的選擇與來(lái)源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)等的相關(guān)研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定；如主要原材料購(gòu)自其他供貨商，應(yīng)提供的資料包括：對(duì)物料供應(yīng)商審核的相關(guān)資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。1.核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料。2.RT-PCR組分的主要材料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)研究資料，主要包括以下內(nèi)容：（1）脫氧三磷酸核苷（dNTP）核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對(duì)純度、濃度、保存穩(wěn)定性等驗(yàn)證資料。（2）引物由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化。需提供對(duì)序列準(zhǔn)確性、純度、穩(wěn)定性、功能性實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證資料。如為外購(gòu)，應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。（六）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料基本生產(chǎn)工藝主要包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對(duì)pH、電導(dǎo)率等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。生產(chǎn)工藝研究資料應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控體系設(shè)置、Ct（臨界）值確定等，提供確切的依據(jù)，主要包括以下內(nèi)容：1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。2.反應(yīng)原理介紹。3.基因位點(diǎn)選擇、RT-PCR方法學(xué)特性介紹。4.確定最佳RT-PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度等。5.確定RT-PCR反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間及循環(huán)數(shù)的研究資料。6.對(duì)于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。7.不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述。（七）分析性能評(píng)估資料企業(yè)應(yīng)提交原廠在產(chǎn)品研制階段對(duì)試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，包括具體研究方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。對(duì)于流感病毒核酸類定性檢測(cè)試劑，建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究。1.流感病毒核酸（RNA）提取病毒RNA提取主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保證靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是決定RT-PCR成敗的要素之一。RNA極易受RNA酶（RNase）的降解，而臨床標(biāo)本和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中存在大量的RNase，因此，無(wú)論申報(bào)產(chǎn)品是否含有RNA分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)對(duì)核酸提取的環(huán)節(jié)做充分的驗(yàn)證。除最大量分離出目的RNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。傳統(tǒng)的RNA分離純化方法（如表面活性劑加蛋白酶結(jié)合氯仿-酚抽提法）和改良方法（如硅磁性微粒吸附法）均有或多或少的優(yōu)勢(shì)和不足，申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合申報(bào)產(chǎn)品的特性，合理選擇RNA分離/純化試劑，并提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。2.最低檢測(cè)限（分析靈敏度）（1）最低檢測(cè)限的確定建議使用培養(yǎng)后病毒原液的梯度稀釋液進(jìn)行最低檢測(cè)限確定，每個(gè)梯度的病毒稀釋液重復(fù)3～5份，每份進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測(cè)，將具有90%～95%陽(yáng)性檢出率的病毒水平作為最低檢測(cè)限。（八）參考值（參考范圍）確定資料對(duì)于此類試劑，參考值確定資料主要是指Ct值的確認(rèn)資料，建議申請(qǐng)人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對(duì)申報(bào)產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的臨界值予以確認(rèn)。（九）穩(wěn)定性研究資料穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、運(yùn)輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料?？紤]到病毒RNA極易被降解的特性，企業(yè)也應(yīng)對(duì)樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，主要包括冷藏和冷凍兩種條件下的有效期驗(yàn)證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇3～5個(gè)溫度點(diǎn)（應(yīng)至少包括范圍的上限和下限溫度），每間隔一定的時(shí)間段即對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行全性能的分析驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類型樣本的效期穩(wěn)定性。在對(duì)樣本進(jìn)行效期穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)時(shí)，同時(shí)應(yīng)對(duì)推薦使用的采樣拭子、樣本保存液及保存容器進(jìn)行合理驗(yàn)證。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲(chǔ)存條件及有效期】和【樣本要求】?jī)身?xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說明。（十）臨床試驗(yàn)研究1.研究方法對(duì)于已有同類產(chǎn)品上市的試劑的臨床研究，選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為參比試劑，采用擬申報(bào)產(chǎn)品（以下稱考核試劑）與之進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)研究，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。另外，申請(qǐng)人還應(yīng)選擇一定數(shù)量的新鮮采集樣本進(jìn)行考核試劑與流感病毒檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法—病毒分離培養(yǎng)鑒定方法的比較研究，每種樣本類型不少于30例經(jīng)病毒分離培養(yǎng)方法確定為陽(yáng)性的樣本。對(duì)于無(wú)法選擇參比試劑的新型流感病毒核酸檢測(cè)試劑，其臨床研究應(yīng)選擇病毒分離培養(yǎng)鑒定和/或病毒核酸序列測(cè)定方法作為參比方法，總例數(shù)不少于500例。用于核酸序列測(cè)定的引物序列應(yīng)不同于考核試劑中用于檢測(cè)目的基因的引物序列。四、名詞解釋四、名詞解釋1.分析特異性（AnalyticalSpecificity）：測(cè)量程序只測(cè)量被測(cè)量物的能力。分析特異性用于描述檢測(cè)程序在樣本中有其他物質(zhì)存在時(shí)只測(cè)量被測(cè)量物的能力。通常以一個(gè)被評(píng)估的潛在干擾物清單來(lái)描述，并給出在特定醫(yī)學(xué)相關(guān)濃度值水平的分析干擾程度。注：潛在干擾物包括干擾物和交叉反應(yīng)物。2.精密度（Precision）：在規(guī)定條件下，相互獨(dú)立的測(cè)試結(jié)果之間的一致程度。精密度的程度是用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得到的測(cè)量不精密度的數(shù)字形式表示，如標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）。五、參考文獻(xiàn)五、參考文獻(xiàn)1.《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法（試行）》，（國(guó)食藥監(jiān)械〔2007〕229號(hào)），2007年4月19日2.《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，（國(guó)食藥監(jiān)械〔2007〕240號(hào)），2007年4月28日3.《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》，（國(guó)食藥監(jiān)械〔2007〕240號(hào)），2007年4月28日4.Establishingt