基因工程基本操作過程(目的基因與運載體結(jié)合).ppt

1、1、目標基因與載體的結(jié)合，是基因工程的基本操作過程，1、2、基因工程，又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學為基礎，利用分子生物學和微生物學的現(xiàn)代方法為手段，從不同來源的基因按照預先設計的藍圖在體外構(gòu)建雜交的DNA分子，然后將它們導入活細胞，改變生物體原有的遺傳特征，獲得新的品種并生產(chǎn)出來?；蚬こ碳夹g(shù)為研究基因的結(jié)構(gòu)和功能提供了強有力的手段?；蚬こ桃兀喊ㄍ庠碊NA、載體分子、工具酶和受體細胞等。a，3，1。目標基因的提取。目標基因與載體的結(jié)合(基因表達載體的構(gòu)建)是基因工程的核心。3.將靶基因?qū)胧荏w細胞4。目的基因的檢測和表達重組DNA技術(shù)的切割、嫁接、轉(zhuǎn)化、擴增、檢測、操

2、作步驟：a、4、a、5。外源DNA片段與載體分子連接的方法，即體外DNA分子重組技術(shù)，主要依靠限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用?；蛑亟M3360使用限制性內(nèi)切酶和其他酶。切割和修飾載體DNA和靶基因以連接它們，將靶基因插入到自我復制載體中，然后將其轉(zhuǎn)移到受體細胞中，以便外源靶基因可以在受體細胞中被擴增或正確表達。a，6，根據(jù)不同的研究目的，精心設計了最終構(gòu)建的重組分子。需要考慮以下兩個方面。如果研究目的是：(1)為了表達有價值的蛋白質(zhì)，選擇合適的調(diào)控序列和終止序列如啟動子和增強子，將目標基因置于啟動子轉(zhuǎn)錄起點的下游，并檢查閱讀框是否正確是非常重要的。(2)為了分析某一基因上游序列的調(diào)節(jié)功能，有

3、必要考慮選擇合適的報告基因，并將可能具有調(diào)節(jié)功能的靶基因置于報告基因上游的合適位置。如果調(diào)節(jié)基因可以起到增強子的作用，那么應該在報告基因下游的適當位置插入一個功能基因，從而反映增強子的作用。1.結(jié)扎前準備，a，7，a，8。為了將目標基因重組到載體分子中，需要適當處理載體DNA和目標基因，以便它們可以相互連接形成新的重組分子。2.結(jié)扎前治療，a，9。載體DNA通常有許多限制性位點，但不是所有的限制性位點都可以用于重組切割。理想的限制性位點應滿足以下條件：載體上的特異性限制性位點應盡可能少，優(yōu)選單個限制性位點，以確保目標基因和載體DNA以最高概率正確結(jié)合。2)在限制性位點之前應該有一個強啟動子，因

4、此3)在基因轉(zhuǎn)錄和連接后翻譯的過程中，所選擇的載體不得改變編碼區(qū)的閱讀框架。1。向量的要求，a，10。當用相同的限制性酶切割載體和外源DNA時，形成的DNA末端可以相互匹配，并且可以通過T4連接酶共價連接以形成重組分子。然而，當目標片段的末端與載體不匹配時，有必要轉(zhuǎn)換一個或兩個片段的末端形式以連接它們。這種末端轉(zhuǎn)化通常通過以下三種方式進行：3凹端展平：用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段部分展平3凹端，不匹配的3凹端轉(zhuǎn)化為粘性端；或者完全變平以產(chǎn)生一個末端鈍的DNA分子，該分子可以與任何其他末端鈍的DNA連接。3-末端切除：T4噬菌體DNA聚合酶具有很強的3-5核酸外切酶活性，可以切除3-

5、末端。平端加合成接頭：合成接頭是兩種化學合成的寡核苷酸的等摩爾混合物，兩種寡核苷酸相互互補，并且兩種寡核苷酸可以形成具有一個或多個限制性酶位點的平端雙鏈體。因此，通過在鈍端DNA上添加接頭，可以在亞克隆操作中添加一個或多個限制性內(nèi)切酶位點。2.結(jié)扎前處理：末端轉(zhuǎn)換，a，11。載體脫氧核糖核酸和目標基因脫氧核糖核酸之間的聯(lián)系。根據(jù)DNA片段的不同末端性質(zhì)，有以下不同的連接方法：粘端連接、平端連接、均聚物加尾連接、人工接頭連接，以及用載體連接三個基因的四種方法。a 12 1。與相同限制性位點的連接3360由相同限制性內(nèi)切酶切割的不同的DNA片段是完整的只要從酶切割突出的單鏈的粘性末端和酶切割位點附

6、近的DNA序列不影響連接，重組的DNA分子可以在連接酶的作用下形成。上述方法的缺點是限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的帶有粘性末端的載體DNA分子在連接反應中經(jīng)常發(fā)生自環(huán)化，并在連接酶的作用下再次成為穩(wěn)定的共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)。溶液：線性載體DNA分子用細菌堿性磷酸酶預處理以除去其5-末端的磷酸基團。(1)粘性末端DNA片段的連接，a，13，a，14，2。不同的限制性位點連接由兩種不同限制性內(nèi)切酶切割的：個DNA片段，這兩種酶具有相同類型的粘性末端，稱為互補末端。外源DNA和載體DNA被兩種限制性內(nèi)切酶切割后，一邊產(chǎn)生粘性末端，另一邊產(chǎn)生扁平末端(你可以先制造粘性末端，然后再制造扁平末端)。a，15，a，16，雙向消

7、化片段定向克隆的優(yōu)點，外源DNA只能在一個方向插入重組質(zhì)粒，從而便于靶基因的正確轉(zhuǎn)錄和表達。載體與外源性DNA結(jié)合處的限制性內(nèi)切酶位點保留，在被相應的限制性內(nèi)切酶切割后，可隨時從重組載體中分離出目的基因。不會自行循環(huán)，轉(zhuǎn)化率高。大多數(shù)轉(zhuǎn)化的細菌克隆攜帶帶有目標基因的重組質(zhì)粒。一些核酸內(nèi)切酶如Hae和Hpa切割的DNA片段沒有粘性末端，但有扁平末端。末端扁平的限制載體只能與末端扁平的目標基因連接。T4DNA連接酶可以催化由相同或不同限制性酶切割的鈍端之間的連接。平端連接比粘端連接困難得多，并且其連接效率非常低，約為粘端連接的1%。適用于限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的鈍端，適用于填充或切割粘性端形成的鈍端

8、。(2)鈍端連接，a，18，a，19，提高鈍端連接效率的方法包括：增加連接酶的量(比粘端連接多10倍)，增加鈍端底物的濃度，增加分子間碰撞的機會；加入10%聚乙二醇8000，促進大分子之間的有效相互作用；加入一價陽離子(氯化鈉)。a，20，當不可能在載體兩端的限制性位點和外源性DNA片段之間找到合適的匹配時，解決方法是人工接頭連接：通過依次添加和連接來合成DNA接頭，然后使用限制性酶消化來解決該問題。同源尾連接法：可以通過使用末端轉(zhuǎn)移酶在載體的限制性位點和外源性DNA片段的3個末端添加互補的同源尾來解決。聚合酶鏈反應方法：利用聚合酶鏈反應技術(shù)擴增外源基因片段，從而添加一個合適限制性酶的單一識別

9、序列，然后用限制性酶消化來解決這個問題。a，21，同聚體加尾連接：用末端轉(zhuǎn)移酶將一段寡核苷酸加到載體和外源雙鏈DNA的3個末端，制成人工粘性末端，不同的寡核苷酸應分別加到外源DNA和載體DNA分子上。在脫氧核糖核酸連接酶的作用下，連接成重組脫氧核糖核酸。這種方法可以應用于任何來源的DNA片段。然而，該方法很復雜，需要核酸外切酶、S1核酶和末端轉(zhuǎn)移酶的協(xié)同作用。(3)均聚物拖尾法，A，22，A，23，均聚物拖尾法實際上是一種人工粘端連接法。優(yōu)點：通過DNA拖尾，不僅可以連接兩個平端的DNA片段，而且平端的DNA片段也可以與粘端的DNA片段連接。缺點：它只對質(zhì)粒載體有效；很難控制質(zhì)粒和cDNA上的

10、均聚物的長度，a，24，人工接頭(DNA寡核苷酸連接)是一種合成的短雙鏈DNA序列，具有一個或幾個特定的限制性內(nèi)切酶識別和切割序列。在平端加入新的酶切位點，然后用限制性內(nèi)切酶切掉粘端，進行粘端連接。(4)人工接頭連接法，a，25，a，26，優(yōu)點：是一種有效實用的DNA重組方法，具有均聚物拖尾法和粘端連接法的優(yōu)點，可根據(jù)不同的實驗要求設計不同限制性酶位點的人工接頭。如果在體外連接反應中增加人工接頭的濃度，平端DNA片段之間的連接效率將大大提高。缺點：如果待克隆的DNA片段或基因也含有與人工接頭相同的限制性酶位點，在消化人工接頭的同時，會將克隆的外源基因切割成不同的片段，產(chǎn)生粘性末端，從而給后續(xù)操

11、作帶來麻煩。自從杰克遜等人于1973年在分子生物學學會上首次提出基因可以被人工重組并在細菌中復制以來，27歲。此后，基因工程作為一個新的研究領域迅速發(fā)展，基礎研究和應用研究都取得了可喜的成果。這是生命科學發(fā)展的一次飛躍，進入了生物性狀定向快速轉(zhuǎn)化的新時代，受到了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。在過去的幾十年中，已經(jīng)進行了基因工程研究，并且已經(jīng)建立了多種載體受體系統(tǒng)，它們分別適用于微生物、動物和植物的轉(zhuǎn)基因。已經(jīng)克隆了許多有用的靶基因，開發(fā)了幾十種昂貴的基因工程藥物，培育了許多具有特殊特征的轉(zhuǎn)基因動物和植物。基因工程成就：20世紀基因工程取得了巨大的進步。至少有兩個強有力的證據(jù)。一個是轉(zhuǎn)基因動植物，另一個是克隆技術(shù)。轉(zhuǎn)基因動物和植物被植入新的基因，這使得動物和植物有了它們以前沒有的全新特征，從而引發(fā)了一場農(nóng)業(yè)革命。如今，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已被廣泛應用，如抗蟲番茄和快速生長的鯽魚。1997年，世界十大科技突破之一是克隆羊的誕生。這只名叫多莉的母羊是第一只通過無性繁殖產(chǎn)生的哺乳動物，它完全繼承了母羊的遺傳基因，正是這些基因賦予了它細胞核?！翱寺　币欢瘸蔀槿藗冴P(guān)注的焦點。盡管存在倫理和社會問題，生物技術(shù)的巨大進步給了人類更廣闊的想象未來的空間。a，29，a，30，現(xiàn)在，一個國際合作的基因組測序項目已經(jīng)完成。隨著功能基因的不斷發(fā)展，分離和轉(zhuǎn)基因