基因工程考綱

1、第一章 緒論1. 基因工程的定義在體外對不同生物的遺傳物質（基因）進行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細菌質粒、病毒或噬菌體DNA），轉入微生物、植物或動物細胞內進行無性繁殖，并表達出基因產物。2. 基因工程的造作路線1) 目的基因的獲取2) 重組體的制備3) 轉化4) 克隆鑒定5) 目的基因擴增6) 目的基因表達第二章 基本操作的主要技術原理第一節(jié) 核酸的分離與純化1. DNA的提取主要步驟1) 生物材料的準備【選取DNA含量高的組織以及生長期】2) 裂解細胞 3) 分離和抽提DNA4) DNA濃縮例子：大腸桿菌質粒DNA的提取2. RNA分離純化（主要步驟不作要求）注意事項：RNA

2、比DNA更不穩(wěn)定，而RNase又無處不在，避免RNA酶的作用1) 避免外源RNase的污染：所有用于植被RNA的玻璃器皿均要滅菌處理2) 抑制內源性RNase的活性：在破碎細胞的同時加入強變性劑使RNase失活3) 在RNA的反應體系內加入RNase的抑制劑第二節(jié) 凝膠電泳1. 電泳基本原理：1) 帶電荷的分子在電場中會以一定的速率向與其電荷性質相反的電極移動，速度稱為電泳遷移率2) 電泳遷移率同電廠的強度和分子本身所帶的凈電荷數(shù)目成正比3) 電泳遷移率同分子與介質的摩擦系數(shù)成反比第三章 分子克隆工具酶第一節(jié) 限制性核酸內切酶1. 概念：是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由

3、此處切割DNA雙鏈的核酸內切酶2. 識別位點：以環(huán)狀和線狀雙鏈DNA為底物，使兩條核糖鏈上特定位置3,5-磷酸二酯鍵斷開，產生3-OH基團和5-p基團片段。3. 酶切位點：內切酶可以在識別位點上將DNA的3,5-磷酸二酯鍵水解斷開4. 內切酶的反應溫度：不同的酶的最適反應溫度不同，大多數(shù)是37C，少數(shù)要求40-65C5. 內切酶的Star活性l 某種內切酶在特定條件下，可在不是原識別序列處切割DNA，這種現(xiàn)象稱為內切酶的Star活性l 幾乎所有的內切酶均有Star活性l Star活性出現(xiàn)的頻率因采用的內切酶底物DNA和反應條件不同而不同6. DNA分子片段化（DNA常用的切割方法）：單酶切法、

4、雙酶切法、部分酶切法【名詞解釋】酶切位點、識別序列，以及兩者的聯(lián)系區(qū)別內切酶的兩種切割方式：粘性末端、平末端內切酶的Star活性第二節(jié) DNA連接酶1. DNA連接酶特點：1）被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子2）羥基和磷酸基團之間形成磷酸二酯鍵是一種耗能反應（大腸桿菌利用NAP+作為能源，動物和噬菌體利用ATP作為能源第三節(jié) 其他工具酶1. DNA聚合酶包括：大腸桿菌聚合酶（全酶）、Klenow大片段酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶共同特點：具有糾錯和聚合的功能（能把脫氧核糖核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA鏈的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用）2. 堿性磷酸酶

5、特點：能夠催化核算分子脫掉5-p基團，從而使DNA（或RNA）片段的5-p末端轉換成5-OH末端使用：為了防止線性化的載體分子發(fā)生自我連接，移去5-p基團3. 反轉錄酶第四章 第一節(jié) 分子克隆載體的特點一、 【基因克隆載體】：在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進入受體細胞的DNA分子叫做載體1. 克隆載體的DNA分子必須具備的條件：（未完）l 在宿主細胞內能獨立復制l 有選擇性標記l 有一段多克隆位點，外源DNA插入其中不影響載體的復制l 分子量小，拷貝數(shù)多l(xiāng) 容易在宿主細胞中分離純化二、 質粒克隆載體1. 【質?！浚菏仟毩⒂谌旧w以外的能自主復制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。存在于細菌、霉菌、

6、；藍藻、酵母等細胞中2. 【質粒的不親和性】：3. 構建質粒克隆載體的基本策略（1） 能在轉化的受體細胞中進行有效的復制，希望在受體細胞中有較多的拷貝數(shù)（2） 必須含有允許多源DNA片段克隆位點（3） 必須含有供選擇克隆子的標記基因（4） 克隆載體質粒分子盡可能小（5） 根據(jù)特殊需要，使構建的質粒載體中組裝各種：元件“例如：PBR322質粒構建步驟（1） 在體內將R1drd19質粒易位子Tn3易位到pMB3（2） 縮小pMB3體積，并保留其復制起點：用EcoRI消化pMB3，成為pMB8，pMB8失去了對amp基因（3） 將帶有抗藥性的DNA片段導入pMB8，EcoRI切割pSC101，然后同

7、pMB8連接形成pMB94. 【pUC質粒載體】：是在pBR322質粒載體的基礎上，組入了一個在其5-端帶有一段多克隆位點的lacZ基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測特性的信箱質粒載體系列第二節(jié) 病毒（噬菌體）克隆片段1. 噬菌體載體1) 性質：噬菌體是由DNA和外殼蛋白組成，是溫和噬菌體，長度約為48000bp，有61個基因，DNA上有56種內切酶識別位點2) 選用噬菌體作為構建克隆載體的依據(jù)：l 噬菌體是一種溫和噬菌體l 能承載較大外源DNA片段，DNA上有20Kb區(qū)域對噬菌體的生長不是絕對需要的l 在DNA上有許多內切酶識別位點3) 構建噬菌體克隆載體的基本策略a) 用內切酶切去DNA上的非

8、必需區(qū)（用EcoRI部分切割DNA；用點突變或甲基化酶處理，使必需區(qū)酶的EcoRI識別位點失效b) 在DNA的必需區(qū)內組入選擇性標記基因c) 構建重組DNA分子體外包裝系統(tǒng)2. 柯斯質粒（cosmid載體，粘性載體）1) 特征：是一種4-6kb的環(huán)形雙鏈DNA，具有DNA的cos序列和控制包裝的序列2) 優(yōu)點：a) 具有質粒載體的特性（具有pBR322質粒的復制子、抗藥性基因和幾個限制性酶的單一位點；有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點，便于選擇）b) 高容量的克隆能力（45kb）：兼有了噬菌體載體和pBR322質粒載體的優(yōu)點第五章 一、 目的基因制備方法（四種大方法，物理化學法中的三個方法

9、原理不用背，其余的原理要記，四種方法使用情況）1. 直接分離法（1） 內切酶酶切分離法（2） 基因分離的物理化學法A. 密度梯度離心法B. 單鏈酶解法C. 分子雜交法（3） 雙抗體免疫法分離編碼蛋白基因（4） 利用酶促反轉錄法直接從特定mRNA分離基因2. 構建基因組文庫分離法（1） 【基因文庫】：某一種生物群體中的全部基因（2） 【cDNA文庫的構建】A. cDNA：以mRNA為模板逆轉錄出的DNAB. cDNA文庫：利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉入細菌細胞中進行繁殖、保存和擴增，稱cDNA文庫C. 構建cDNA文庫的一般步驟：a) 總RNA提取和mRN

10、A的分離純化b) cDNA的合成和克隆c) cDNA與載體連接d) 噬菌體的包裝、轉染及質粒DNA的轉化l 兩種文庫的區(qū)別3. 利用PCR反應擴增目的基因4. 基因的化學合成：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法和自動化合成法【名詞解釋】基因克隆：指包含某些特定基因或DNA片段的克隆基因文庫中包含著為數(shù)眾多的克隆，建成后可供隨時選取其中任何一個基因克隆之用二、 從基因文庫中篩選目的基因1 目的基因的功能克?。?） 根據(jù)特異蛋白分離目的基因原理：（2） 功能互補克隆法原理：利用被克隆DNA片段與宿主細胞染色體在功能上有同源互補性來進行目的基因分離2 序列克隆法（1） 根據(jù)已知基因序列

11、或同源基因序列分離目的基因原理：（核酸探針進行雜交篩選）從GenBank中查找有關基因序列，用該序列做探針篩選基因克隆第六章 PCR技術1. PCR技術基本原理（1） 【DNA變性】：雙鏈DNA在受熱后，配對堿基的氫鍵斷裂，DNA兩條鏈分開成為單鏈。這些單鏈正好成為復制新的DNA模板（2） 【DNA復性】：人工合成的單鏈DNA小片段的堿基順序分別與所要擴增的DNA雙鏈的5端相同，因而能與模板DNA復性成小段雙鏈，充當體內DNA復制時的引物（類似體內復制過程中的RNA引物）（3） 【DNA延伸】：DNA聚合酶按堿基配對原則在模板上延伸DNA鏈 ，類似體內的DNA的前導鏈復制（4） 新一輪循環(huán)開始

12、：變性復性延伸（5） 循環(huán)的反復l 理論上25-30次循環(huán)就可以合成2的25-30次方l 循環(huán)原因，溫度，目的，結果2. 影響PCR因素（1） Taq DNA聚合酶A. 熱穩(wěn)定性：耐高溫，適合在PCR過程中的反復高溫變性要求（2） 引物（3） 模板：純度、模板量（4） dNTP：02mmol/L，濃度過高會抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加錯配率（5） Mg2+的濃度：1.5mmol/L的MgCl23. PCR中容易出現(xiàn)的問題以及解決辦法（1） 假陽性：不應出現(xiàn)而出現(xiàn)A 原因：樣品污染、擴增試劑污染、擴增產物交叉污染B 解決辦法：隔離工作區(qū)、改進操作、避免試劑污染（2） 假陰性：該出現(xiàn)不出現(xiàn)A

13、 原因：DNA樣品中含有Taq酶抑制劑、DNA樣品中含有重金屬等B 解決辦法：第七章 目的基因導入受體細胞第一節(jié) 受體細胞以及重組體分子導入受體細胞1. 受體細胞2. 受體細胞選擇原則（九個，未完）（1） 便于重組DNA分子導入（2） 能是重組DNA分子穩(wěn)定存在于細胞中（3） 便于重組體的篩選（4） 遺傳穩(wěn)定性高，易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長（5） 安全性高、無致病性3. 重組質粒DNA分子轉化大腸桿菌轉化：重組質粒DNA分子通過與膜蛋白結合進入受體細胞，并在受體細胞內穩(wěn)定維持和表達的過程4. 重組DNA分子轉入真核細胞（1） 重組DNA分子導入植物細胞A 農桿菌介導的Ti質粒轉化法B DNA直接轉移法：（一句話簡述原理）多聚物介導法：聚乙二醇等可以試細胞膜間接觸粘連、電荷紊亂、有利于細胞膜間融合和外源DNA進入顯微注射法：電穿孔法：激光微束穿孔法：激光束引起細胞膜可逆性穿孔脂質體介導