實(shí)驗動物設(shè)計模板

1、實(shí)驗動物設(shè)計大綱實(shí)驗名稱：普通小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( rsv)感染模型比較 課題來源：自選 設(shè)計班級：*級*本科*班 設(shè)計人員：* * * * 設(shè)計日期：*年*月*日 成都醫(yī)學(xué)院實(shí)驗技術(shù)教研室2010年制一、立題依據(jù)（一）目的與意義 比較研究balb/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( rsv) 感染模型的特點(diǎn),建立理想動物模型, 為研究發(fā)病機(jī)理和防治措施奠定基礎(chǔ)。（二）國內(nèi)外研究現(xiàn)狀人呼吸道合胞病毒( human respiratory syncytial virus, rsv) 是全球嬰幼兒下呼吸道感染首位病毒病原體, 幾乎所有兒童兩歲前感染過至少一次rsv1,年齡越小病情越重, 再感

2、染率高, 與哮喘發(fā)生密切相關(guān)2。免疫缺陷者更易感染, 臨床癥狀更為嚴(yán)重,常致死亡3。每年住院治療的50%-75% 嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎和25% 40% 的肺炎是rsv直接引起, 1 歲內(nèi)嬰兒rsv感染率68.8%, 1-2 歲感染率達(dá)82.6%100%。嬰兒期急性rsv 下呼吸道感染使非特應(yīng)體質(zhì)和特應(yīng)體質(zhì)兒童發(fā)生哮喘危險性都比普通兒童明顯增加, 是哮喘的獨(dú)立危險因素4雖然已有許多抗rsv 制劑和疫苗的研究, 但尚無安全有效的防治方法?？箁sv 制劑的研究需要建立理想的動物模型, 但目前已建立的系列感染模型均不夠滿意。肺組織rsv抗原保護(hù)性免疫僅能維持?jǐn)?shù)月, 福爾馬林滅活疫苗不能起到保護(hù)作用反而加

3、重病情, 至今rsv 仍無安全有效的治療藥物和預(yù)防疫苗, 脫氧核酶等新型抗rsv制劑正在研究中, 已在體外無細(xì)胞體系和細(xì)胞模型中表現(xiàn)抗病毒活性, 需要建立恰當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ? 進(jìn)一步在體內(nèi)研究其抗病毒作用5。從rsv 發(fā)現(xiàn)至今,已建立的黑猩猩、獼猴、雪貂、牛、棉鼠、豚鼠和小鼠等感染模型各有優(yōu)勢和局限6, 除靈長類動物可出現(xiàn)臨床癥狀, 其他都是無癥狀隱性感染7。balb/c小鼠為近交繁殖產(chǎn)生，其對多種病原體具有易感性，利用小鼠建立模型的優(yōu)點(diǎn)是它易獲得, 遺傳背景清楚而均一, 基因改造技術(shù)成熟, 已有多種商品化試劑, 是目前應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗動物。但小鼠不是rsv 自然宿主, 我們以往實(shí)驗發(fā)現(xiàn)balb/

4、c 鼠感染rsv 沒有臨床癥狀, 肺內(nèi)病毒復(fù)制水平相對低, 病毒滴度下降快, 帶毒時間短, 限制了治療效果的觀察8。裸小鼠采用nu+雌鼠與nunu雄鼠交配方法產(chǎn)生，這種無毛小鼠是由于第11號染色體等位基因突變引起的，裸小鼠主要特征是無毛、裸體和無胸腺，缺乏成熟t細(xì)胞的免疫功能，b淋巴細(xì)胞正常，成年裸小鼠較普通小鼠有較高水平的nk細(xì)胞活性，目前未做過裸小鼠rsv感染模型，對其優(yōu)勢和局限尚不完全清楚。（三）存在的問題目前雖然已有許多抗rsv 制劑和疫苗的研究, 但尚無安全有效的防治方法，rsv感染具體發(fā)病機(jī)制也不夠清楚，其發(fā)病機(jī)制和抗rsv 制劑的研究需要建立理想的動物模型, 但目前已建立的系列感

5、染模型均不夠滿意。（四）解決問題的思路 復(fù)制balb/c鼠和裸鼠rsv感染模型 ，不同時間空斑形成實(shí)驗檢測肺組織病毒滴度, 計數(shù)支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)和分類情況, 免疫熒光和免疫組化檢測rsv 抗原, 光鏡和電鏡檢查肺組織病理學(xué)改變，比較研究balb/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( rsv) 感染模型的特點(diǎn)。參考文獻(xiàn)：1 blackcp. systematicreviewofthebiologyandmedical management ofrespiratory syncytial virus infectionj. respiratory care, 2003; 48( 3) :20

6、9- 233.2 holt pc, s1y pd.interactions between rsv infection, asthma andatopy: unraveling the complexities j. j exp med, 2002; 196( 10) :1271- 1275.3 meissner hc, rennelsmb, pickeringlk, et al.risk of severe respiratorysyncytial virus disease, identification of high risk infants and recommendationsfo

7、r prophylaxis with palivizumabj.pediatr infect dis j, 2004;23( 3) : 284- 285.4 oddywh, de merk nh, s1y pd, et a1. the effects of respiratory infections,atopy and breastfeeding on childhood asthma j.eur respir j,2002; 19( 5) :899- 905.5 zhaoc- a,zhaox- d,yuh- get al. inhibitionofrespiratory syncytial

8、virus replication in cultured cells by rna cleaving dnazyme j.chin jpediatr, 2003; 41( 8) : 594- 598.6 schmidt ac, johnson tr, peter jm, et al.respiratory syncytial virusand other pneumoviruses: a review of the international symposium- rsv2003j.virus research, 2004; 106 : 1- 13.7 mcarthur- vaughan k

9、, gershwin lj.a rhesus monkey model of respiratorysyncytial virus infectionj.j med primatol, 2002; 31( 2) : 61- 73.8 lian g- l, yu h- g, zhaox- d, et al.establishment of respiratory syncytialvirus infection model in micej. j xian jiaotonguniversity( medicalsciences) , 2003; 24( 4) : 329- 332. 二、實(shí)驗設(shè)計

10、方案（一）實(shí)驗設(shè)計目標(biāo)，擬解決的關(guān)鍵問題設(shè)計目標(biāo)：比較研究balb/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( rsv) 感染模型的特點(diǎn),以建立理想動物模型擬解決的關(guān)鍵問題：balb/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( rsv) 感染模型的復(fù)制，對試驗性rsv 感染的模型進(jìn)行分組與實(shí)驗結(jié)果分析。（二）實(shí)驗設(shè)計1、實(shí)驗動物設(shè)計（1）遺傳背景balb/c鼠遺傳背景：近交系balb/c小鼠裸小鼠遺傳背景：采用nu+雌鼠與nunu雄鼠交配方法產(chǎn)生的同源導(dǎo)入近交系小鼠（2）微生物質(zhì)量控制balb/c小鼠微生物質(zhì)量要求：普通級動物要求。裸小鼠微生物質(zhì)量要求： spf（無特定病原體）或無菌要求 （3）育種繁殖balb/

11、c小鼠育種繁殖：繁殖方法：近交繁殖初始動物的選擇：挑選一對或幾對具有育種目標(biāo)要求的性狀的全同胞兄妹性別鑒定：1、雄鼠的生殖器距肛門較遠(yuǎn)2、雄鼠生殖器與肛門之間長毛3、雄鼠的生殖器較雌鼠大4、雌鼠乳頭較雄鼠明顯性成熟期：35-55日齡；實(shí)配年齡：60日齡左右；成熟時體重：20克以上發(fā)情鑒定：動情期小鼠外陰部腫脹紅潤，撫摸其身體出現(xiàn)脊柱前凹、抬臀等行為現(xiàn)象配種：動情前期交配 交配形式：采用全同胞兄妹交配形式妊娠診斷：摸胎法、陰道涂片法、外形涂片法、直腸檢查法育種代數(shù)：作為親本的全同胞兄妹（初始動物）記為0代，按雌雄1：1進(jìn)行交配，所生后代記為第1代，從中又選留滿意的一對或幾對全同胞兄妹作親本，按雌

12、雄1：1進(jìn)行交配，以此類推，直到20代以上個體選擇：選擇留繁殖力強(qiáng)，生活力強(qiáng)，特別是目標(biāo)性狀和基因保種方法：平行線系統(tǒng)擴(kuò)大繁殖生產(chǎn)方法：交通信號燈方法裸小鼠育種繁殖:繁殖方法：近交繁殖（同源導(dǎo)入近交）初始動物的選擇：挑選一對或幾對具有育種目標(biāo)要求的性狀的全同胞兄妹性別鑒定：1、雄鼠的生殖器距肛門較遠(yuǎn)2、雄鼠的生殖器較雌鼠大3、雌鼠乳頭較雄鼠明顯發(fā)情鑒定：動情期小鼠外陰部腫脹紅潤，撫摸其身體出現(xiàn)脊柱前凹、抬臀等行為現(xiàn)象配種：動情前期交配交配形式：采用nu+雌鼠與nunu雄鼠交配方法，雌雄比例為1：1，有時可采用1：2或1：3妊娠診斷：摸胎法、陰道涂片法、外形涂片法、直腸檢查法（平均每胎所得純合子

13、仔鼠能占仔數(shù)的550，離乳率97，14胎生育恒定，一年存活率達(dá)100 ，最長生存期可達(dá)752 d。）育種代數(shù)：作為親本nu+雌鼠與nunu雄鼠記為0代，按雌雄1：1進(jìn)行交配，所生后代記為第1代，從中又選留滿意的一對或幾對全同胞兄妹作親本，按雌雄1：1進(jìn)行交配，以此類推，直到20代以上個體選擇：選擇留繁殖力強(qiáng)，生活力強(qiáng)，特別是目標(biāo)性狀和基因保種方法：平行線系統(tǒng)擴(kuò)大繁殖生產(chǎn)方法：交通信號燈方法（4）飼養(yǎng)管理balb/c小鼠飼養(yǎng)管理:balb/c小鼠環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗動物飼養(yǎng)室的溫度為18-19，相對濕度為40%-70%，每小時換氣次數(shù)為10-20次，噪聲在60分貝以下，每立方米空氣中氨濃度在14mg以

14、下，工作照度為150-300lxbalb/c小鼠設(shè)施：開放系統(tǒng)balb/c小鼠籠器具：采用無毒塑料籠具，墊料選用具良好吸濕性、無毒性、無異味、塵埃少的材料如電刨花，墊料須經(jīng)高壓蒸汽滅菌balb/c小鼠飼喂：飼喂小鼠全價營養(yǎng)顆粒飼料，飼料的消毒滅菌應(yīng)達(dá)到相應(yīng)等級小鼠微生物控制的要求。飼喂采取“少量勤添”的原則，每周喂料3-4次，飲水應(yīng)保證連續(xù)不斷，每周換水2-3次，墊料每周更換1-2次balb/c小鼠飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生消毒：做好室內(nèi)的清潔、消毒、及飼料籠器具的清洗消毒，每次飼養(yǎng)完后，用苯扎溴銨擦拭籠架、地板，每月定期徹底噴霧消毒1次裸小鼠飼養(yǎng)管理:裸小鼠環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗動物飼養(yǎng)室的溫度為18-19，相對

15、濕度為40%-70%，每小時換氣次數(shù)為10-20次，噪聲在60分貝以下，每立方米空氣中氨濃度在14mg以下，工作照度為150-300lx，空氣潔凈度為100000級裸小鼠設(shè)施：屏障系統(tǒng)或隔離系統(tǒng)裸小鼠籠器具：采用無毒塑料籠具，墊料選用具良好吸濕性、無毒性、無異味、塵埃少的材料如電刨花，一般所有的籠具、墊料、飼料、飲水等都得經(jīng)過滅菌消毒 裸小鼠飼喂：每周飼喂全價營養(yǎng)飼料23次。飼料、飲水、墊料及鼠籠均用雙層包布包裝高壓蒸汽滅菌消毒。進(jìn)室前經(jīng)緩沖室紫外燈照射后去除外層包布，才能進(jìn)入繁殖室及實(shí)驗室裸小鼠飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生消毒： 繁殖室設(shè)在空氣過濾十萬級環(huán)境中放置層流柜作為裸小鼠繁殖飼養(yǎng)條件。啟用前，先用2

16、新潔而滅全面擦拭，然后按消毒區(qū)域的容積用高錳酸鉀15 g，in2加福爾馬林15 ml混和熏蒸。最后經(jīng)紫外燈照射，細(xì)菌培養(yǎng)陰性才使用。啟用后我們的常規(guī)消毒是：進(jìn)實(shí)驗室前后紫外燈照射30 rain，每2周用2新潔而滅擦拭墻壁、天花板，每一個月用過氧乙酸噴射消毒。每三個月用甲醛和高錳酸甲熏蒸一次(用備用實(shí)驗室輪流消毒和使用)。每三個月將層流柜的過濾材料拆下進(jìn)行清洗。每年更換一次過濾材料。飼養(yǎng)人員定期入繁殖室進(jìn)行飼養(yǎng)管理操作。進(jìn)室前需淋浴并用新潔而滅常規(guī)泡手、消毒、穿無菌衣、帶襪的無菌褲、戴口罩、帽子。外層穿上手術(shù)隔離衣，并帶手術(shù)膠手套及無菌紗手套。每次操作完畢，用新潔而滅抹臺面及地面。常規(guī)每周換兩次

17、籠具，投放3 4 d的飼料與飲水。每周加兩次雞蛋和瓜子及一次維生素。2、實(shí)驗專業(yè)設(shè)計選用balb/c鼠和裸小鼠作為實(shí)驗動物，感染rsv 后不同時間空斑形成實(shí)驗檢測肺組織病毒滴度, 計數(shù)支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)和分類情況, 免疫熒光和免疫組化檢測rsv 抗原, 光鏡和電鏡檢查肺組織病理學(xué)改變3、實(shí)驗統(tǒng)計設(shè)計結(jié)果用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示, 兩兩組間比較用t 檢驗, 各組間比較用方差分析。= 0.05,p0.05 認(rèn)為有顯著性差異。4、實(shí)驗方法設(shè)計(1) 實(shí)驗技術(shù)路線balb/c小鼠c ：感染6 天的balb/c 小鼠b ：感染3 天的balb/c 小鼠a ：對照balb/c 小鼠d ： 對照裸鼠裸小鼠f

18、 ：感染6 天的裸鼠e ：感染3 天的裸鼠不同時間空斑形成實(shí)驗檢測肺組織病毒滴度, 計數(shù)支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)和分類情況, 免疫熒光和免疫組化檢測rsv 抗原, 光鏡和電鏡檢查肺組織病理學(xué)改變(2) 實(shí)驗技術(shù)方法1）隨機(jī)抽樣：選正常成年健康體重相近的balb/c小鼠30只和裸小鼠30只，分別將30只balb/c小鼠和30只裸小鼠按體重由小變大編號后，從隨機(jī)數(shù)字表中查取隨機(jī)數(shù)字，依次抄錄于小鼠編號下。具體方法：兩種動物編號為130號，30只balb/c小鼠按照能被3除的規(guī)律：不余到a組，余1到b組，余2到c組 ；30只裸小鼠balb/c小鼠按照能被3除的規(guī)律：不余到d組，余1到e組，余2到f

19、組 2）實(shí)驗分組：實(shí)驗分六組： a ：對照balb/c 小鼠 b ：感染3 天的balb/c 小鼠c ：感染6 天的balb/c 小鼠 d ： 對照裸鼠e ：感染3 天的裸鼠f ：感染6 天的裸鼠3）模型復(fù)制病毒和細(xì)胞培養(yǎng): hep- 2 細(xì)胞接種rsv 標(biāo)準(zhǔn)a2 株病毒, 含2% 胎牛血清( fbs) dmem培養(yǎng)至病變達(dá)90%100%, 吸取培養(yǎng)液, 4, 3000g 離心10min收集上清, - 80儲存?zhèn)溆谩２《窘臃N: balb/c小鼠和無特殊病原菌( specific pathogen free, spf) 級812 周齡、雌性裸鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉0.06mg/g 麻醉后, 感染

20、組鼻腔緩慢滴入2106pfu/ ml rsv a2 株病毒液50l, 陰性對照組滴入50l 2% fbs dmem。4)取材病毒分離和滴度分析:感染后不同時間處死小鼠, 無菌條件下取左肺、肝臟和脾臟稱重, 按10ml/g( wt/vol) 加入預(yù)冷組織平衡液, 勻漿制備肺臟、肝臟和脾臟組織懸液, 4, 2500g 離心10min, 取上清接種于hep2 細(xì)胞, 2% fbs 1640 培養(yǎng)基, 37 , 5% co2 培養(yǎng), 逐日觀察細(xì)胞病變。同時取肺組織懸液上清空斑形成實(shí)驗分析肺組織病毒滴度。5) 相關(guān)指標(biāo)測定:空斑形成實(shí)驗測定病毒滴度:3105/ml vero 細(xì)胞接種至6 孔板, 10%

21、fbs 的1640 培養(yǎng)至單層致密無孔細(xì)胞, 接種10 倍倍比稀釋的病毒液100l, 每個濃度設(shè)復(fù)孔, 未感染病毒為對照孔。病毒吸附2h 后覆蓋含1.5%的瓊脂糖凝膠和2% fbs 的1640 培養(yǎng)基, 培養(yǎng)5 天, 5mg/ml mtt 顯色, 計數(shù)空斑, 計算病毒滴度: pfu/ml= 稀釋度 p= 該濃度下各孔空斑數(shù); n= 復(fù)孔數(shù); v= 每孔接種病毒液體積(ml)支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞計數(shù):感染后第3 天、6 天和9 天處死小鼠, 氣管插管, 預(yù)冷生理鹽水0.5ml 灌洗2 次, 收集支氣管肺泡灌洗液( balf) , 血球計數(shù)儀計數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。4, 1000g 離心10min, 取

22、細(xì)胞沉渣涂片,wright 染色, 顯微鏡下計數(shù)200 個白細(xì)胞, 按中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)分類計數(shù)。直接免疫熒光實(shí)驗:取感染后第3 天小鼠balf 離心細(xì)胞沉渣涂片, 4丙酮固定干燥, 按light diagnostics respiratory panel 1 dfa 免疫熒光試劑盒說明書( chemicon, usa) 鑒定rsv 抗原, 熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。肺組織病理學(xué)檢查:感染后第3 天、6 天處死小鼠, 取未經(jīng)支氣管肺泡灌洗的右肺組織, 一部分4%多聚甲醛固定, 常規(guī)蘇木素- 伊紅( he) 染色, 光鏡觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)。另一部分立即2.5%戊二醛固定, 送重慶醫(yī)科大學(xué)電鏡室包埋、制成超薄切片, 透射電鏡檢查。免疫組織化學(xué)檢查:rsv 抗原免疫組織化學(xué)染色sp 染色試劑盒( 北京中杉生物技術(shù)公司) , 一抗是針對rsv 整個病毒抗原的山羊多克隆抗體( usbiological, usa) 。4%多聚甲醛固定肺組織, 常規(guī)