食品中菌落總數(shù)和大腸菌群的檢測(cè)

1、,2011年食品企業(yè)質(zhì)量檢驗(yàn)人員培訓(xùn),太倉市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所,質(zhì)檢所詹克航,2011.09.15,菌落總數(shù)與大腸菌群的測(cè)定,二、大腸菌群的檢測(cè),一、菌落總數(shù)測(cè)定法,太倉市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所,主講人：詹克航 2011.09.15,目前，食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的微生物指標(biāo)一般分為菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌三項(xiàng)。 細(xì)菌計(jì)數(shù) 食品中菌落總數(shù)通常指1g，1ml或1cm2面積食品上的細(xì)菌數(shù)目而言的，而不考慮其種類。 由于檢測(cè)計(jì)數(shù)方法的不同, 一般有兩種表示方法（菌落總數(shù)和細(xì)菌總數(shù)）。,食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的微生物指標(biāo)概論,菌落總數(shù): 菌落（Colony）,菌落(colony)：生長(zhǎng)在固體培養(yǎng)基上，來源于一個(gè)細(xì)胞，肉眼

2、可見的細(xì)胞群體。,一種是在嚴(yán)格規(guī)定條件下（樣品處理，培養(yǎng)基及其pH培養(yǎng)溫度與時(shí)間、計(jì)數(shù)方法等），使適應(yīng)這些條件的每一個(gè)活菌細(xì)胞必須而且只能生成一個(gè)肉眼可見的菌落，經(jīng)過計(jì)數(shù)所獲得的結(jié)果稱為該食品的菌落總數(shù)。,另一種是將食品經(jīng)過適當(dāng)處理（溶解和稀釋）后，在顯微鏡下對(duì)細(xì)菌細(xì)胞數(shù)進(jìn)行直接計(jì)數(shù)，這樣計(jì)數(shù)的結(jié)果，既包括活菌，也包括尚未被分解的死菌體，因此稱為細(xì)菌總數(shù)。 目前我國(guó)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的細(xì)菌總數(shù)實(shí)際上是指菌落總數(shù)。即指的是在平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落數(shù)。,那么檢測(cè)食品中的菌落總數(shù)有何衛(wèi)生學(xué)意義呢？ 一方面，它可以作為食品被污染程度的標(biāo)志。檢測(cè)食品中的菌落總數(shù)，可以了解食品在生產(chǎn)中，從原料加工到成

3、品包裝受外界污染的情況從而反映食品的衛(wèi)生質(zhì)量。一般來說、菌落總數(shù)越多，說明食品的衛(wèi)生質(zhì)量越差，遭受病原菌污染的可能性越大。而菌落總數(shù)僅少量存在時(shí)，病原菌污染的可能性就會(huì)降低或者幾乎不存在。 許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，食品中細(xì)菌總數(shù)能夠反映出食品的新鮮程度、是否變質(zhì)以及生產(chǎn)過程的一般衛(wèi)生狀況等。一般來講，食品中細(xì)菌總數(shù)越多，則表明該食品污染程度越重，腐敗變質(zhì)的可能性越大。,另一方面，它可以用來預(yù)測(cè)食品可能存放的期限程度。如實(shí)驗(yàn)表明，菌數(shù)為105cfu/cm2的魚，在0下可保持6d，而菌數(shù)為103cfu/cm2時(shí)，保存期可達(dá)12d。 但上述規(guī)則也有例外，有些食品成品的菌落總數(shù)并不高，但由于已有細(xì)菌繁殖并已

4、產(chǎn)生了毒素，且毒素性狀穩(wěn)定，仍存留于食品中；再有一些食品如酸泡菜和酸乳等，本身就是通過微生物的作用而制成的，且是活菌制品。,自然界細(xì)菌的類很多，各種細(xì)菌的生理特性和所要求的生活條件不盡相同，（如嗜溫菌30-37，4.83hr；嗜冷菌 20-25 5-7d或5-10 10-14d；嗜熱菌 45-55 2-3天）如果要檢驗(yàn)樣品中所有種類，必須用不同培養(yǎng)基及不同培養(yǎng)條件去滿足其要求，才能把各種細(xì)菌都檢驗(yàn)出來，這樣工作量將會(huì)很大。 我們也知道，自然界盡管細(xì)菌種類很多，但異養(yǎng)、中溫、好氣性細(xì)菌占絕大多數(shù)。因此，嚴(yán)格講，用這種方法所得到的結(jié)果，主要是一些能在平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的，好氧性嗜溫細(xì)菌的菌落

5、總數(shù)。但是把它們作為細(xì)菌總數(shù)已得到公認(rèn)。這不僅在食品的衛(wèi)生檢驗(yàn)中，而且在一切微生物區(qū)系分析中，都把它們作為了細(xì)菌總數(shù)的指標(biāo)。 注意：是并不是所有食品都規(guī)定細(xì)菌指標(biāo)，如酸乳、酸泡菜等。,因此，菌落總數(shù)的測(cè)定對(duì)評(píng)價(jià)食品的新鮮度和衛(wèi)生質(zhì)量有著一定的衛(wèi)生指標(biāo)的作用，但本能單憑此一項(xiàng)指標(biāo)來判定食品的衛(wèi)生質(zhì)量，還必須配合大腸菌群和致病菌等檢驗(yàn)，才能作出比較全面、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。,一、菌落總數(shù)測(cè)定法,菌落總數(shù)（ aerobic plate count） 食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等)，所得1mL(或1g)檢樣中形成菌落的總數(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的培養(yǎng)條件下所得結(jié)果

6、，只包括一群在平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)發(fā)育的嗜中溫需氧菌或兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。,GB/T 4789.2-2010,本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 4789.2-2008相比主要修改如下： 修改了標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱；(食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定/食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定) 修改了菌落總數(shù)計(jì)算公式中的解釋； 修改了培養(yǎng)基和試劑； 刪除了第二法 菌落總數(shù)PetrifilmTM 測(cè)試片法。(培養(yǎng)基由營(yíng)養(yǎng)瓊脂改為平板計(jì)數(shù)瓊脂；菌落總數(shù)計(jì)算公式進(jìn)行了修改；增加了第二法“菌落總數(shù)PetrifilmTM測(cè)試片法”；)-2008,3.設(shè)備和材料,3.1恒溫培養(yǎng)箱：361301。3.2冰箱：25。3.

7、3恒溫水浴箱：461。3.4天平：感量0.1g。3.5 均質(zhì)器3.6 振蕩器3.7無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及其吸頭。3.8無菌錐形瓶：容量為250mL、500mL。3.9無菌培養(yǎng)皿：直徑為90mm。3.10pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。3.11放大鏡或/和菌落計(jì)數(shù)器或PetrifilmTM自動(dòng)判讀儀。 3.12無菌刀、剪子、鑷子等。,4培養(yǎng)基和試劑,4.1平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基 (Plate count agar PCA)，見附錄A中A.1。 pH 7.00.2 4.2磷酸鹽緩沖稀釋液，見附錄A中A.2。 pH 7.2 4.3 無菌生理鹽

8、水,見附錄A中A.3 ：稱取8.5g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121高壓滅菌15min。 (4.4 1 mol/L 氫氧化鈉（NaOH）：稱取40g氫氧化鈉溶于1000mL水中。 4.5 1 mol/L 鹽酸（HCl）：移取濃鹽酸90mL，用蒸餾水稀釋至1000mL 4.6 PetrifilmTM菌落總數(shù)測(cè)試片（aerobic count plate）和壓板。) 4.7 75%乙醇。,區(qū)別：pH值（08： pH 7.00.2；03： pH 7.27.4 ）,細(xì) 菌 學(xué) 檢 驗(yàn) 程 序 -細(xì)菌總數(shù) 5、 第一法 平板菌落計(jì)數(shù)法,6、操作步驟,6.1.1固體和半固體食品：以無菌操作稱取25g

9、樣品，放入于裝有225 mL磷酸鹽緩沖稀釋液或0.85生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min10000 r/min均質(zhì)1min2min，制成1:10樣品勻液；或放入于225 mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min2min制成1:10的樣品勻液。6.1.2液體樣品：以無菌吸管吸取樣品25mL放入裝有225mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液（表面取樣的樣品按一定的比例制成1:1樣品勻液和/或1:10樣品勻液。）。,6.1樣品的稀釋,6.1.3用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1.0 mL，

10、沿管壁緩慢注于裝有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。 6.1.4另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，如此每遞增稀釋一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。6.1.5根據(jù)對(duì)樣品污染情況的估計(jì)，選擇23個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），分別在做10倍遞增稀釋的同時(shí)，吸取1.0 mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)分別取1mL稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿作空白對(duì)照。6.1.6樣品勻液移入平皿后，應(yīng)及時(shí)將涼至46平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(可放置于461恒溫

11、水浴箱中保溫)注入平皿約15mL20mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。同時(shí)將平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1.0 mL空白稀釋液的無菌平皿內(nèi)作對(duì)照。,6.2培養(yǎng),6.2.1 瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，361培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h2h。水產(chǎn)品采用301培養(yǎng)72h3h(08新增)。 6.2.2 瓊脂凝固后，如果懷疑樣品中含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL），并在報(bào)告上記錄該操作，待覆蓋層凝固，翻轉(zhuǎn)平板，按6.2.1條件進(jìn)行操作,6.3菌落計(jì)數(shù),可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄相應(yīng)的菌落數(shù)量和稀釋倍數(shù)。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony forming un

12、its,CFU）表示。6.3.1平板菌落數(shù)的選擇 選取菌落數(shù)在30CFU300CFU個(gè)之間、無蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU個(gè)菌落的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板平均數(shù)。,6.3.2 其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2，代表全平板菌落數(shù)。 6.3.3 當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，即將每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。如有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)(菌落之間無明顯界線)，若僅有一條鏈，可視為一個(gè)菌落；

13、如果有不同來源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)。,1、平皿分4部分點(diǎn)數(shù)（見圖） 2、求同一稀釋度的平均菌落數(shù) 如： A1數(shù) + A2數(shù) 2,6.4、菌落計(jì)數(shù)方法,1.若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克（毫升）中菌落總數(shù)結(jié)果。 （見表例1）。 2.若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)（30300個(gè)菌落）時(shí)，按如下公式計(jì)算： N= C/(n1 +0.1n2)d 式中： N 樣品中菌落數(shù)； C 平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和； n1 第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)； n2 適宜范圍菌落數(shù)的第二稀釋度（高稀釋倍

14、數(shù)）平板個(gè)數(shù)； d 稀釋因子（第一稀釋度）；,7. 結(jié)果的表述,7.1菌落總數(shù)的計(jì)算方法：,示例： 稀釋度 1:100（第一稀釋度） 1:1000（第二稀釋度） 菌落數(shù) 232，244 33，35 N= C/(n1 +0.1n2)d(232+244+33+35)/(2+0.12) 10-2 =544/0.022=24727 上述數(shù)據(jù)經(jīng)“四舍五入”后，表示為25000 或 2.5104。 3. 若所有平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表例4）。,4. 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表例5） 5. 若所

15、有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，其中一 部分大于300或小于30時(shí)，則以最接近30或300的平均菌 落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之 （見表例6）。 6. 若所有稀釋度的菌落數(shù)均不可計(jì)數(shù)，則以最高稀釋倍數(shù)無法計(jì)數(shù) 報(bào)告之（見表例7）。,菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告: 菌落數(shù) 報(bào)告結(jié)果 1、 30300 之間 平均菌落數(shù) X 稀釋倍數(shù) 2、在30300之間(若有兩個(gè)稀釋度) 按新公式計(jì)算 （舊標(biāo)準(zhǔn)：求比值 2 取較小稀釋倍數(shù) ； 300 最高稀釋度平均菌落數(shù) X 最高稀釋倍數(shù) 4、 300 或 30 取最接近的 X 稀釋倍數(shù) 6、 無法計(jì)數(shù) 報(bào)告無法計(jì)數(shù),稀釋度選擇及細(xì)菌總數(shù)報(bào)告方法（表7） 稀釋液及菌落數(shù)

16、 10-1 10-2 10-3 1 1,365 164 20 16，400 16，000或1.6104 2 2,760 295 46 37，750 3.1000或3.1103 2,890 271 60 27，100 3 不可計(jì) 4，650 513 513，000 510，000或5.1 105 4 27 11 5 270 270或2.7 102 5 無菌落 無菌落 無菌落 1 10 10 6 不可計(jì) 305 12 30，500 31，000或3.1 10-3,稀釋 倍數(shù),平均,菌落,數(shù),例 次,細(xì)菌總數(shù),(個(gè)/g或個(gè)/ml),報(bào)告方式,(個(gè)/g或個(gè)/ml),7.2.1菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按“

17、四舍五入”方式修約，采用兩位有效數(shù)字報(bào)告。7.2.2大于或等于100時(shí)，前第3位數(shù)字采用“四舍五入”方式修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)來表示結(jié)果；也可用10的指數(shù)形式來表示，此時(shí)也按“四舍五入”方式修約，采用兩位有效數(shù)字。7.2.3若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。7.2.4若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無效。7.2.5稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，按體積取樣的以CFU/mL為單位報(bào)告(表面取樣以CFU/cm2報(bào)告)。,7.2、菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告：,二、食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù),在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。,GB

18、 4789.3-2003,GB 4789.3-2010,其中包括大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌和一些中間類型的細(xì)菌，這群細(xì)菌能在含有膽鹽的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。實(shí)際上包括埃希氏菌屬、檸檬酸細(xì)菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬等，其中以埃希氏菌屬為主，稱為典型大腸桿菌，其它三屬稱為非典型大腸桿菌。,由于大腸菌群都是直接或間接來自人或溫血?jiǎng)游锏募S便，來自糞便以外的極為罕見，所以大腸菌群作為食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)有以下兩方面的意義。 一方面，它可以作為糞便污染食品的指標(biāo)菌。如果食品中檢出大腸菌群，表明該食品曾受到人或溫血?jiǎng)游锛S便污染。如有典型大腸桿菌存在，說明該食品受到糞便近期污染。如有非典型大腸桿菌存在，說明該食品受到糞便陳舊污染。

19、 另一方面，它可以作為腸道致病菌污染食品的指標(biāo)菌。威脅食品安全性的主要是腸道致病菌。,我國(guó)和許多國(guó)家的大腸菌群檢驗(yàn)結(jié)果均采用大腸菌群MPN來表示，2003標(biāo)準(zhǔn)采用每100ml（g）樣品中大腸菌群最近似數(shù)來表示，20082010標(biāo)準(zhǔn)采用每1mL(g)樣品中大腸菌群最近似數(shù)表示。 MPN值是按一定方案檢驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)數(shù)值，這種檢驗(yàn)方案，在我國(guó)GB/T4789.3-2010 中將過去的“采用樣品三個(gè)稀釋度各三管的乳糖發(fā)酵三步法”修改“兩步法”。,GB/T5009.3-2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微 生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù),修改了標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱； “第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法”的平板菌落數(shù)的選擇范圍

20、修改為“15 CFU150 CFU”； 刪除了“第三法大腸菌群PetrifilmTM 測(cè)試片法”。,二、 細(xì) 菌 學(xué) 檢 驗(yàn) 程序-大腸菌群,GB 4789.3-2010,GB 4789.3-2003,3.設(shè)備和材料,3.1 恒溫培養(yǎng)箱：36 1 。 3.2 冰箱：2 5 。 3.3 恒溫水浴箱：46 1 。 3.4 天平：感量0.1 g。 3.5 均質(zhì)器。 3.6 振蕩器。 3.7 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。 3.8 無菌錐形瓶：容量500 mL。 3.9 無菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm。 3.10 pH 計(jì)或pH 比色管

21、或精密pH 試紙。 3.11 菌落計(jì)數(shù)器。,4.培養(yǎng)基和試劑,區(qū)別：培養(yǎng)基pH值（4.1: 6.80.2; 4.2: 7.20.1; 4.3: 7.40.1；4.4: 7.2） 滅菌溫度（121/15min）,4.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉湯： 見附錄A 中A.1。 4.2 煌綠乳糖膽鹽（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉湯： 見附錄A 中A.2。 4.3 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）： 見附錄A 中A.3。 4.4 磷酸鹽緩沖液：見附錄A 中A.4。 4

22、.5 無菌生理鹽水：見附錄A 中A.5。 4.6 無菌1 mol/L NaOH：見附錄A 中A.6。 4.7 無菌1 mol/L HCl：見附錄A 中A.7。,6.1 樣品的稀釋 6.1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g 樣品,放入盛有225 mL 磷酸鹽緩 沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi), 8000 r/min10000 r/min 均質(zhì)1 min2 min,或放入盛有225 mL 磷酸 鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋 中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min2 min，制成1:10 的樣品勻液。 6.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL 樣品置盛有225 mL 磷酸鹽緩 沖液或生理鹽水的無菌

23、錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中， 充分混勻，制成1:10 的樣品勻液。,6 操作步驟,6.1.3 樣品勻液的pH 值應(yīng)在6.57.5 之間，必要時(shí)分別用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)。 6.1.4 用1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1 mL，沿管壁緩緩注入9 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1 mL 無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。 6.1.5 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用1 支

24、1 mL 無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min。,6.2 初發(fā)酵試驗(yàn),每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯/乳糖膽鹽發(fā)酵管，每管接種1mL（如接種量超過1 mL，則用雙料LST肉湯），361 培養(yǎng)24 h2 h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24 h2 h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h2 h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。 2003版增加-分離培養(yǎng):伊紅美藍(lán)瓊脂平板(361 , 24 h2 h),操作示意圖,1mL,1mL,1mL,10-1,

25、10-2,10-3,10-4,10mL,10mL,10mL,1mL,1mL,1mL,1mL,1mL,1mL,空白,S1,S2,1mL,1mL,1mL,滅菌生理鹽水,雙料,復(fù)發(fā)酵 (BGLB/乳糖發(fā)酵管),陽性管進(jìn)行,伊紅美藍(lán)瓊脂,6.3 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn),用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管/乳糖發(fā)酵管中，36 1培養(yǎng)48 h2 h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽性管。,6.4 大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告,按6.3確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B），報(bào)告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。,8.1 樣品的稀釋 按6.1

26、進(jìn)行。 8.2 平板計(jì)數(shù) 8.2.1 選取2個(gè)3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度, 每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無菌平皿，每皿1 mL。同時(shí)取1 mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對(duì)照。 8.2.2 及時(shí)將15 mL20 mL冷至46 的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3 mL4 mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36 1 培養(yǎng)18 h24 h。,8.3 平板菌落數(shù)的選擇,選取菌落數(shù)在15 CFU150 CFU 之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。 典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm 或

27、更大。,8.4 證實(shí)試驗(yàn),從VRBA 平板上挑取10 個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB 肉湯管內(nèi)，36 1 培養(yǎng)24 h48 h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB 肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。,8.5 大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告,經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以8.3中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4 樣品稀釋液1 mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。,8.6 培養(yǎng)基和試劑,A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯,A.1.1 成分 胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 氯化鈉 5.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸氫二鉀（K2HPO4） 2.75 g 磷酸二氫鉀（KH2PO4） 2.75 g 月桂基硫酸鈉 0.1 g 蒸餾水 1 000 mL pH 6.