三代測(cè)序技術(shù)發(fā)展及其他.pptx

1、三代測(cè)序技術(shù)發(fā)展及它,-LXF 2013.4.10,1,第一代測(cè)序技術(shù),原理： 1.Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977) 2.MaxamGilbert DNA化學(xué)降解法(Maxam &Gilbert,1977),2,Dideoxynucleotides（雙脫氧核苷酸）,ddNTPs 是反應(yīng)終止劑 可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。 反應(yīng)體系中dNTPs的濃度遠(yuǎn)高于ddNTPs(一般3-4：1)。,3,Sanger雙脫氧終止法,與 PCR反應(yīng)類(lèi)似； 反應(yīng)體系中包含：模板 DNA,Taq酶, dNTPs, ddNTPs和測(cè)序引物； 反應(yīng)過(guò)程： 變性復(fù)

2、性延伸終止,4,Sanger第一步：加入復(fù)制終止劑,5,ddNTPs參與下的DNA復(fù)制,Sanger法測(cè)序產(chǎn)物的平均 鏈長(zhǎng)取決于ddNTP：dNTP的比例,比例高時(shí)，得到較短的產(chǎn)物； （BigDye， HiDi） “標(biāo)記終止法”測(cè)序產(chǎn)物 的平均長(zhǎng)度可通過(guò)標(biāo)記反應(yīng)中dNTP濃度(高濃度能得到長(zhǎng)的產(chǎn)物)或終止反應(yīng)的ddNTP:dNTP來(lái)調(diào)整。,6,Sanger第二步：熒光檢測(cè),7,Gel ElectrophoresisDNA Fragment Size Determination,DNA 帶負(fù)電 DNA在電泳膠中的遷移率 與其片段大小有關(guān),8,關(guān)于ABI3730 xl,毛細(xì)管規(guī)格: 96道毛細(xì)管

3、毛細(xì)管長(zhǎng)度: 50cm 凝膠的規(guī)格: POP-7液體分離膠 配套的試劑: 基因測(cè)序(BigDye3.1v和5Sequence buffer) 基因分型(Liz120, Liz500, ROX500) 基因測(cè)序及分型的運(yùn)行時(shí)間 時(shí)間：96樣本 2h 通量：（94-96）/384*12 讀長(zhǎng)：700-900bp,9,長(zhǎng)片段的測(cè)序,Primer Walking：獲得未知克隆的序列信息，或者驗(yàn)證克隆序列的準(zhǔn)確性。如果提供參考序列，可以一次完成長(zhǎng)片段克隆的全長(zhǎng)測(cè)序。,Fragment1,Fragment2,Fragment3,Fragment4,Legend：,Primer,Fragment,10,基于

4、ABI3730 xl平臺(tái)的擴(kuò)展應(yīng)用,1. Gene Synthesis：,protein/DNA sequence of interest design oligos order oligos Run 1st round PCR (assembly) Run 2nd round PCR (amplification) ligate into vector, transform Pick colony and screen recombinants by colony PCR Sequencing recombinants Plasmid minipreparation 4 day betwee

5、n PCR amplification and sequencing-confirmed plasmid (at best!),11,基于ABI3730 xl平臺(tái)的擴(kuò)展應(yīng)用,2. STR: STR/SSR: 是由長(zhǎng)度為2-7個(gè)堿基的核苷酸序列重復(fù)構(gòu)成的多態(tài)性DNA標(biāo)記，由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度可變性，因此在同一個(gè)基因位點(diǎn)創(chuàng)造了多個(gè)不同的等位基因。微衛(wèi)星分析通常被用來(lái)創(chuàng)建遺傳圖譜，連鎖分析以及對(duì)遺傳性狀的追蹤。 原理：在一端引物上標(biāo)記特定的熒光,通過(guò)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度大小，檢測(cè)基因型.,12,基于ABI3730 xl平臺(tái)的擴(kuò)展應(yīng)用,2. STR:,13,基于ABI3730 xl平臺(tái)的擴(kuò)展

6、應(yīng)用,3. SNP: 傳統(tǒng)測(cè)序法 金標(biāo)準(zhǔn),14,基于ABI3730 xl平臺(tái)的擴(kuò)展應(yīng)用,3. SNP: 傳統(tǒng)測(cè)序法 金標(biāo)準(zhǔn),15,基于ABI3730 xl平臺(tái)的擴(kuò)展應(yīng)用,3. SNP: SNaPshot 適合5-12個(gè)及以上的SNP位點(diǎn)的檢測(cè) 該檢測(cè)方法的主要原理為單堿基延伸技術(shù)，并且利用引物片段的大小，從而把不同位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果區(qū)分開(kāi)。,16,基于ABI3730 xl平臺(tái)的擴(kuò)展應(yīng)用,17,基于ABI3730 xl平臺(tái)的擴(kuò)展應(yīng)用,18,基于ABI3730 xl平臺(tái)的擴(kuò)展應(yīng)用,19,基于ABI3730 xl平臺(tái)的擴(kuò)展應(yīng)用,3. SNP: SNPlex SNPlex Genotyping Syste

7、m是基于熒光檢測(cè)方法來(lái)進(jìn)行。 DNA模板直接與一套3個(gè)探針組成的系統(tǒng)結(jié)合，這3個(gè)探針包括2個(gè)等位基因探針ASO和1個(gè)位點(diǎn)特異探針LSO。當(dāng)ASO探針和LSO探針與模板完全匹配時(shí)，連接酶連接兩條探針。然后使用生物素標(biāo)記的PCR引物擴(kuò)增該連接產(chǎn)物。生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合在鏈霉親核素包被的雜交板孔中，通過(guò)堿變性的方法使生物素標(biāo)記的單鏈PCR產(chǎn)物保留在雜交板中，然后該單鏈PCR產(chǎn)物與一套通用Zipchute探針雜交結(jié)合。這些探針帶有熒光標(biāo)記，它們具有特殊的片段與單鏈PCR 產(chǎn)物的特殊部位互補(bǔ)，還包含有修飾部分，一條Zipchute 探針對(duì)應(yīng)一個(gè)待檢測(cè)等位基因，然后將雜交捕獲到的Zipchute 探針

8、分離出來(lái)，通過(guò)毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)，最后通過(guò)GeneMapper軟件分析來(lái)確定SNP基因型。,20,基于ABI3730 xl平臺(tái)的擴(kuò)展應(yīng)用,21,第二代測(cè)序平臺(tái),454 (GS-FLX) Solexa SOLiD,22,454 (GS-FLX),原理： 依賴(lài)于核苷酸摻入中焦磷酸鹽的釋放。該技術(shù)是由波爾尼倫和穆斯塔法羅納吉于1996年在斯德哥爾摩的皇家工學(xué)院發(fā)展出來(lái)的。 454的突破之處： 將試劑和模板統(tǒng)統(tǒng)都吸附在一個(gè)個(gè)微珠上，然后把這些微珠一個(gè)個(gè)地放到芯片上的小孔中，每孔一個(gè)微珠。保證了反應(yīng)的獨(dú)立性，節(jié)省試劑耗材。,23,GS FLX系統(tǒng)的流程概括起來(lái)，就是“一個(gè)片段 = 一個(gè)磁珠 = 一條讀長(zhǎng)

9、（One fragment = One bead = One read）”。 1）樣品輸入并片段化：GS FLX系統(tǒng)支持各種不同來(lái)源的樣品，包括基因組DNA、PCR產(chǎn)物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。大的樣品例如基因組DNA或者BAC等被打斷成300800 bp的片段；對(duì)于小分子的非編碼RNA或者PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，這一步則不需要。短的PCR產(chǎn)物則可以直接跳到步驟3)。,24,2）文庫(kù)制備：借助一系列標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將A和B接頭（3和5端具有特異性）連接到DNA片段上。接頭也將用于后續(xù)的純化，擴(kuò)增和測(cè)序步驟。具有A、B接頭的單鏈DNA片段組成了樣品文庫(kù)。 3）一個(gè)DNA片段一個(gè)磁珠：?jiǎn)?/p>

10、鏈DNA文庫(kù)被固定在特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠上。每一個(gè)磁珠攜帶了一個(gè)獨(dú)特的單鏈DNA片段。磁珠結(jié)合的文庫(kù)被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含一個(gè)磁珠和一個(gè)獨(dú)特片段的微反應(yīng)器。,25,4）乳液PCR擴(kuò)增：每個(gè)獨(dú)特的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而沒(méi)有其他的競(jìng)爭(zhēng)性或者污染性序列的影響。整個(gè)片段文庫(kù)的擴(kuò)增平行進(jìn)行。對(duì)于每一個(gè)片段而言，擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬(wàn)個(gè)相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合在磁珠上。,26,一個(gè)磁珠一條讀長(zhǎng),27,454 (GS-FLX),小結(jié)： GS FLX系統(tǒng)的流程概括起來(lái)，就是“一個(gè)片段 = 一個(gè)磁珠 = 一條讀長(zhǎng)（One fragm

11、ent = One bead = One read）”。 GS FLX系統(tǒng)在10小時(shí)的運(yùn)行當(dāng)中可獲得100多萬(wàn)個(gè)讀長(zhǎng)，讀取超過(guò)4-6億個(gè)堿基信息。 GS FLX系統(tǒng)的準(zhǔn)確率在99%以上。其主要限制來(lái)自同聚物，也就是相同堿基的連續(xù)摻入，如AAA或GGG。454測(cè)序平臺(tái)的主要錯(cuò)誤類(lèi)型是插入-缺失，而不是替換。,28,Illumina公司的新一代測(cè)序儀Genome Analyzer最早由Solexa公司研發(fā)，利用其專(zhuān)利核心技術(shù)“DNA簇”和“可逆性末端終結(jié)（reversible terminator）”，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化樣本制備及基因組數(shù)百萬(wàn)個(gè)堿基大規(guī)模平行測(cè)序。,Illumina 測(cè)序儀,29,Geno

12、me Analyzer技術(shù)的基本原理,1. 文庫(kù)制備將基因組DNA打成幾百個(gè)堿基（或更短）的小片段，在片段的兩個(gè)末端加上接頭(adapter)。,30,Genome Analyzer技術(shù)的基本原理,2. 產(chǎn)生DNA簇利用專(zhuān)利的芯片，其表面連接有一層單鏈引物，DNA片段變成單鏈后通過(guò)與芯片表面的引物堿基互補(bǔ)被一端“固定”在芯片上。另外一端（5或3）隨機(jī)和附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被“固定”住，形成“橋 (bridge) “。反復(fù)30輪擴(kuò)增，每個(gè)單分子得到了1000倍擴(kuò)增，成為單克隆DNA簇。DNA簇產(chǎn)生之后，擴(kuò)增子被線性化，測(cè)序引物隨后雜交在目標(biāo)區(qū)域一側(cè)的通用序列上。,31,Genome Ana

13、lyzer技術(shù)的基本原理,Genome Analyzer系統(tǒng)應(yīng)用了邊合成邊測(cè)序（Sequencing By Synthesis）的原理。 然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過(guò)可逆性終止的SBS（邊合成邊測(cè)序）技術(shù)對(duì)待測(cè)的模板DNA進(jìn)行測(cè)序。 加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。 這些核苷酸是“可逆終止子”，因?yàn)?羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，它只容許每個(gè)循環(huán)摻入單個(gè)堿基。此時(shí)，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類(lèi)。之后，將這些基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3端粘性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸。如此繼續(xù)下去，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。,32

14、,Genome Analyzer系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì),1. 可擴(kuò)展的超高通量 Genome Analyzer系統(tǒng)目前每次運(yùn)行后可獲得超過(guò)20 GB的高品質(zhì)過(guò)濾數(shù)據(jù)。 2. 需要樣品量少 需要的樣品量低至100ng，能應(yīng)用在很多樣品有限的實(shí)驗(yàn)（比如免疫沉淀、顯微切割等）中。 3. 簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化 提供了最簡(jiǎn)單和簡(jiǎn)潔的工作流程。,33,SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) 原理 ：用連接法測(cè)序獲得基于“雙堿基編碼原理”的SOLiD顏色編碼序列，隨后的數(shù)據(jù)分析比較原始顏色序列與轉(zhuǎn)換成顏色編碼的reference序列，把SO

15、LiD顏色序列定位到reference上，同時(shí)校正測(cè)序錯(cuò)誤，并可結(jié)合原始顏色序列的質(zhì)量信息發(fā)現(xiàn)潛在SNP位點(diǎn)。,SOLID 測(cè)序儀,34,SOLID工作流程,35,SOLID工作流程,Detecting a single color does not indicate a base Each reading contains information from two bases To decode the bases you must know one of the bases in the sequence,36,SOLiD 4-color ligation reaction,37,SOLi

16、D 4-color ligation reaction,38,SOLiD 4-color ligation reaction,39,SOLiD 4-color ligation reaction,40,SOLiD 4-color ligation reaction,If know first base is an A then immediately it decodes 2nd base. This must be an A as Blue translates 2nd base A if first base A,Example :,41,SOLiD 4-color ligation re

17、action,42,優(yōu)勢(shì)： 系統(tǒng)可擴(kuò)展性 最大的靈活性 全基因表達(dá)圖譜分析 更多RNA研究 SNP分析 甲基化分析,SOLID 測(cè)序儀,43,第三代測(cè)序技術(shù),HeliScope Pacific Biosciences：SMRT Oxford Nanopore Technologies,44,HeliScope,Helicos公司：基于單分子邊合成邊測(cè)序的原理,45,HeliScope,基于單分子邊合成邊測(cè)序的原理,46,Heliscope的讀取長(zhǎng)度約為30-35 nt，每個(gè)循環(huán)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出量為21-28 Gb。,PacBio-SMRT,基于邊合成邊測(cè)序的思想，以SMRT芯片為測(cè)序載體進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)

18、。 SMRT芯片是一種帶有很多ZMW(zero-mode waveguides，零模波導(dǎo))孔的厚度為100 nm的金屬片。將DNA聚合酶、待測(cè)序列和不同熒光標(biāo)記的dNTP放入ZMW孔的底部，進(jìn)行合成反應(yīng)。 與其他技術(shù)不同的是，熒光標(biāo)記的位置是3磷酸基團(tuán)而不是5甲基堿基。,47,PacBio-SMRT,48,PacBio-SMRT,當(dāng)一個(gè)dNTP被添加到合成鏈上的同時(shí)，它會(huì)進(jìn)入ZMW孔的熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)并在激光束的激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù)熒光的種類(lèi)就可以判定dNTP的種類(lèi)。 其它未參與合成的dNTP由于沒(méi)進(jìn)入熒光型號(hào)檢測(cè)區(qū)而不會(huì)發(fā)出熒光。在下一個(gè)dNTP被添加到合成鏈之前，這個(gè)dNTP的磷酸基團(tuán)會(huì)被氟聚合物（fluoropolymer）切割并釋放，熒光分子離開(kāi)熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)。,49,PacBio-SMRT,合成過(guò)程中，每次進(jìn)入一個(gè)堿基，原始數(shù)據(jù)會(huì)實(shí)時(shí)地產(chǎn)生一個(gè)脈沖峰，每?jī)蓚€(gè)相鄰的脈沖峰之間有一定的距離。 距離與模板上堿基是否存在修飾有關(guān)，如果有堿基修飾，就會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)相鄰峰之間距離加大。根據(jù)這個(gè)距離的變化，可以判斷模板相應(yīng)位點(diǎn)是否出現(xiàn)堿基修飾，并且結(jié)果是實(shí)時(shí)的?？梢杂糜诩谆葔A基修飾研究。,50,PacBio-SMRT,2012年底，Pacific Biosciences發(fā)布XL系列