植物組織培養(yǎng)的基本原理.ppt

1、第三章 植物組織培養(yǎng)的基本原理,第一節(jié) 植物細(xì)胞全能性和細(xì)胞分化,一、植物細(xì)胞全能性（Totipotency） 1、植物細(xì)胞全能性：1902年由Haberlandt提出，即植物體細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖、發(fā)育成完整植株的能力。 20世紀(jì)80年代，認(rèn)為每一個植物細(xì)胞具有該植物的全部遺傳信息，在適當(dāng)條件下可表達(dá)出該細(xì)胞的所有遺傳信息，分化出植物有機(jī)體所有不同類型細(xì)胞，形成不同類型的器官甚至胚狀體，直至形成完整再生植株。 植物細(xì)胞全能性的證明是通過1958年Steward等胡蘿卜根段細(xì)胞體胚發(fā)生試驗及1964年Guha等進(jìn)行的曼陀羅花藥培養(yǎng)。,從一個細(xì)胞發(fā)育成一個植株,2、全能性表達(dá)：

2、少數(shù)體細(xì)胞在發(fā)育過程中可能丟失或增加一部分遺傳物質(zhì),因而失去全能性。如篩管細(xì)胞,它在發(fā)育過程中失去細(xì)胞核,因而沒有全能性。 由于目前還無法使所有的離體植物細(xì)胞都實現(xiàn)其全能性。多數(shù)情況下只是分生組織等的細(xì)胞能實現(xiàn)。,離體材料在一定條件下仍將按原有的動態(tài)平衡關(guān)系進(jìn)行生命活動，表現(xiàn)其全能性。 決定(Determination)：植物體是由各個層次或小系統(tǒng)如基因水平、細(xì)胞水平、器官水平構(gòu)成的生命大系統(tǒng)，系統(tǒng)內(nèi)和系統(tǒng)間協(xié)調(diào)運(yùn)行不僅是維持植物生長的先決條件，而且它們的動態(tài)平衡關(guān)系還制約著其發(fā)育進(jìn)程。 全能性表達(dá)條件之一：細(xì)胞的孤立是誘發(fā)全能性表達(dá)的重要因素。,脫分化（Dedifferentiation）：

3、已分化的植物細(xì)胞要表達(dá)全能性,必需先脫分化,使細(xì)胞恢復(fù)到胚性階段。 生長素尤其是2,4-對脫分化具有重要作用。 2,4-濃度高時,誘發(fā)不均等分裂；而濃度低時,只誘發(fā)均等分裂。一旦發(fā)生不均等分裂,細(xì)胞就對生長素失去敏感性,在無生長素的條件下能自發(fā)形成體細(xì)胞胚。,全能相對性的啟發(fā)在離體培養(yǎng)的選材上，盡可能選取分生組織的部位。 將實驗?zāi)康呐c外植體生長發(fā)育狀態(tài)(“決定”狀態(tài))相結(jié)合，創(chuàng)造良好的離體條件。 合理使用生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。,二 、細(xì)胞分化（Cell differentiation）,1、概念 （1） 分化：是指植物體各個部分出現(xiàn)異質(zhì)性的現(xiàn)象，包括細(xì)胞分化、組織分化和器官分化。 （2）細(xì)胞分化：指導(dǎo)

4、致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在的發(fā)育方式改變的過程。 細(xì)胞分化是組織分化和器官分化的基礎(chǔ)，是植株離體再生的基礎(chǔ)。,2、植物細(xì)胞分化的某些規(guī)律和機(jī)理,（1） 細(xì)胞分化基本分為形態(tài)結(jié)構(gòu)分化和生理生化分化兩類，生理生化分化在形態(tài)結(jié)構(gòu)分化之前。 （2）分化與極性（Polarity）關(guān)系密切。 （3）生理隔離或機(jī)械隔離在細(xì)胞分化中有促進(jìn)作用。 （4） 細(xì)胞分裂對細(xì)胞分化具有重要作用。,（5）植物生長調(diào)節(jié)劑有明顯調(diào)節(jié)作用。如生長素與分裂素比值，高，促進(jìn)生根；低，芽。 （6）染色體和DNA的變化對細(xì)胞分化影響較大。如DNA 差異復(fù)制。,新種的特征帶SSR 譜帶變異,在DNA水平復(fù)制上的差異,細(xì)胞分化

5、在DNA水平上的體現(xiàn),穎果作外植體. 愈傷組織分化芽,第二節(jié) 離體條件下植物器官的發(fā)生,一、脫分化（Dedifferentiation） 1、概念： 也稱去分化，指離體條件下生長細(xì)胞、組織或器官經(jīng)過細(xì)胞分裂或不分裂逐漸失去原來的結(jié)構(gòu)和功能而恢復(fù)分生狀態(tài)，形成無組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織或不分化細(xì)胞的過程。 如葉柄基部的薄壁細(xì)胞成為離層細(xì)胞；傷害導(dǎo)致局部細(xì)胞形成愈傷組織。,機(jī)理尚未完全闡明。一般認(rèn)為脫分化過程中細(xì)胞膜透性改變，細(xì)胞核增大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)范圍擴(kuò)大，多核糖體形成，過氧化物酶增加，蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)合成活躍等。,2、脫分化的機(jī)理,黃瓜子房組織經(jīng)脫分化形成胚性愈傷組織,（1）損傷。 切割損傷的刺激

6、，促使細(xì)胞增殖。 （2）在誘導(dǎo)愈傷組織時常加入生長素類，但同時配合細(xì)胞分裂素的效果可能更好。 （3）弱光或黑暗條件有利于脫分化中的細(xì)胞分裂。 （4）細(xì)胞位置. 外植體本身的各類細(xì)胞可能對培養(yǎng)條件的刺激有不同的敏感性。 （5）外植體的生理狀態(tài)。不同生理年齡和不同季節(jié)都會有不同的培養(yǎng)反應(yīng)。 （6）植物種類的差異。 一般雙子葉植物比單子葉植物及裸子植物容易。,3、影響脫分化的主要因素,不同部位產(chǎn)生不同脫分化效果,二、再分化（Re-differentiation）,1、概念 ：指離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞和組織可以由脫分化狀態(tài)重新進(jìn)行分化，形成另一種或幾種類型的細(xì)胞、組織、器官，甚至形成完整植株。 （1）細(xì)胞

7、水平再分化：首先是細(xì)胞壁變厚、假導(dǎo)管細(xì)胞的形成，以及酶水平的變化和明顯的機(jī)能分化，從而形成各種類型的細(xì)胞。 （2）組織水平再分化：在高水平生長素條件下，最常見的是維管組織（Vascular tissue）的分化. 松散的愈傷組織內(nèi)含大量擬分生組織或瘤狀結(jié)構(gòu)；致密的愈傷組織內(nèi)組織分化很少，大多由高度液泡化的細(xì)胞組成。,（3）器官水平再分化 ： 依起源不同，分器官型（Organ ）和器官發(fā)生型（Organogenesis ）。 器官型：直接由外植體細(xì)胞形成器官原基，繼而發(fā)育成器官； 器官發(fā)生型：外植體先形成愈傷組織，再由愈傷組織產(chǎn)生不同的器官原基。,（4） 植株再生：根和莖（包括其變態(tài)器官）或芽器

8、官的發(fā)生可使植株重建。 器官發(fā)生再生植株的方式大致有： A 先形成芽，芽的基部后產(chǎn)生根； B 先形成根，根上再出芽； C 愈傷組織的不同部位形成芽和根，然后形成微管束組織把兩者結(jié)合起來. 一些變態(tài)莖、葉器官，離體培養(yǎng)易于形成相應(yīng)的變態(tài)器官。,2、影響細(xì)胞再分化因素： 從理論上講，在離體培養(yǎng)條件下經(jīng)過再分化可獲 得各種類型的細(xì)胞、組織、器官以及再生植株。但是目前，還不能使所有植物的活細(xì)胞都再生植株。主要原因是： （1）不同植物種類再分化的能力差異較大； （2）對某些植物再生條件還沒有完全掌握。,三、愈傷組織（Callus）培養(yǎng),1、愈傷組織形成 在脫分化的過程中，多形成Callus, 其細(xì)胞結(jié)構(gòu)

9、多是異質(zhì)性的，無明顯極性。 （1）誘導(dǎo)期：細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂， 細(xì)胞大小幾乎不變，生理生化變化大，迅速合成蛋白質(zhì)和核酸。 （2）分裂期：外層細(xì)胞分裂，中間細(xì)胞常不分裂，形成小芯。細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少結(jié)構(gòu)，淺而透明。在原培養(yǎng)基上，細(xì)胞會發(fā)生分化，及時轉(zhuǎn)移，其可無限制地進(jìn)行細(xì)胞分裂，維持不分化狀態(tài)。 （3）分化期：停止分裂的細(xì)胞發(fā)生生理代謝變化，出現(xiàn)形態(tài)和功能各異細(xì)胞。,（1）生長：誘導(dǎo)期后，外植體外層細(xì)胞分裂，在組織受傷表面形成一層愈傷組織， Callus的細(xì)胞數(shù)目迅速增多，表層細(xì)胞平均重量下降，體積變小；降低溫度，可以使細(xì)胞生長速度減慢，平均大小可增加。 （2）質(zhì)地類型：松脆和致密兩種。

10、高濃度生長素，可使Callus變得松脆；高濃度細(xì)胞分裂素，則可使致密。 （3）生理生化變化： RNA，同工酶譜帶，次生物質(zhì)合成能力，對激素的馴化（1年或繼代培養(yǎng)10代以上）。,2、愈傷組織的生長,不同生長素濃度下的愈傷組織形成率,不同類型的愈傷組織及其分化,3、愈傷組織的保持 轉(zhuǎn)接,在多數(shù)情況下，隨著繼代培養(yǎng)代數(shù)增加和培養(yǎng)時間的延長，Callus長勢下降、褐變、分化和形態(tài)發(fā)生能力下降、降低甚至死亡。 主要原因：遺傳因素，染色體畸變、基因突變； 生理因素，細(xì)胞或組織內(nèi)激素平衡的改變，細(xì)胞對外源生長物質(zhì)的敏感性改變. 后者可以通過調(diào)控培養(yǎng)條件而恢復(fù)。,4、愈傷組織形態(tài)發(fā)生,（1）過程：外層細(xì)胞分裂，逐漸減慢并停止；內(nèi)部較深處的細(xì)胞開始分裂，而且分裂方向也發(fā)生改變，形成維管化組織和瘤狀結(jié)構(gòu)。 （2）形態(tài)發(fā)生方式：器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生