第三章 氨基酸.ppt

1、第三章 蛋 白 質,第一節(jié) 蛋白質通論 一組成 ：蛋白質分子是由氨基酸 （20種）首尾相連而成的 共價多肽鏈。 元素：C、H、O、N； S、P、Fe、Cu、Mg、 I、Zn、Al等 凱氏 (Kjedahl) 定氮法: 蛋白質含量 = 蛋白氮 6.25,二分類： 單純（簡單）蛋白質 按溶解性分類 按組成分： 綴合（結合）蛋白質 按非氨基酸成分分類 纖維狀蛋白質 2按形狀和溶解度分： 球狀蛋白質 膜蛋白 3按生物功能分： （蛋白質的多樣性）,三蛋白質的大小和分子量： 從大約60001 106 Da（百萬）或更大一些。 對于不含輔基的簡單蛋白質, 用 110 除它的相對分子質量即可約略估計其氨基酸殘

2、基的數目。,四蛋白質的構象 和組織層次： 每一種天然蛋白質都有自己特有的空間結構或稱三維結構, 這種三維結構通常被稱為蛋白質的構象。,第二節(jié)氨 基 酸 一蛋白質的水解： 完全（徹底）水解 AA 不完全（部分）水解 AA 肽 酸水解 方法 堿水解 酶水解,二氨基酸的一般結構 蛋白質氨基酸（基本AA，common, standard amino acid)：20種 非蛋白質氨基酸：200多種,人類對aa的營養(yǎng)需求,人類自身能合成,人類自身不能合成或不能足量合成，必須依賴食物供給。,Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr (His),Gly Ala Ser Tyr Cys P

3、ro Asn Asp Glu Gln Arg,組成蛋白質的氨基酸都為a-氨基酸（除Pro外）,C,酸,氨,不同的 aa 在于 R基團 的不同,一. 氨基酸的結構,組成蛋白質的氨基酸基本上都是L型（除Gly外）,D型 與 L型,R group,Amino group,Carboxylic group,L-Form Amino Acid Structure,H = Glycine,CH3 = Alanine,Mirror Images of Amino Acid,Mirror image,Same chemical properties,Stereo isomers,三. 分類 1. Classi

4、fication of Amino Acids by Chemical construction,要求：？,-C-C-CONH2,-C-CONH2,-C-COOH,-C-C-COOH,-H,-CH3,-C-OH,-C-SH,-C-C-S-C,-C-C-C-C-NH3+,Aliphatic,Amide,Acidic,Imino, Circular,Basic,Sulfur,Hydroxy,Aromatic,POLAR,NON- POLAR,Tyr,His,Gly,Acidic,Neutral,Basic,Asp,Glu,Gln,Cys,Asn,Ser,Thr,Lys,Arg,Ala,Val,Il

5、e,Leu,Met,Phe,Trp,Pro,2. Classification of Amino Acids by Polarity,Polar or non-polar, it is the bases of the amino acid properties.,稀有的蛋白質氨基酸,通常是常見氨基酸的衍生物。 如:4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸,非蛋白質氨基酸,鳥氨酸 (Orn),瓜氨酸,四氨基酸的酸堿性質： 1. 氨基酸是兼性離子（偶極離子 ）： 熔點很高, 一般在 200 以上 ？ 氨基酸能使水的介電常數增高 ？ 2. 氨基酸的二性解離： 氨基酸是一類兩性電解質。氨基酸完全質子化時, 可以看

6、成是多元酸, 側鏈不解離的中性氨基酸可看作二元酸, 酸性氨基酸和堿性氨基酸可視為三元酸。,Proton： abundant and small, affects the charge of a molecule,H+,lone pair electrons,Ampholyte contains both positive and negative groups on its molecule,Proton Is Adsorbed or Desorbed,pKa,pKa,COOH,N H3+,Acidic environment,Neutral environment,Alkaline envi

7、ronment,A+,A-,Ao,pH = pKa + log質子受體/質子供體,OH ,pK1,pK2,pH,pI,Isoelectric point =,Amino Acids Isoelectric point (pI),Ao=A-,A+=Ao,pKa = 1.72.4,pKa = 3.94.3,pKa = 6.0,pKa = 8.3,pKa = 10,pKa = 8.811,pKa = 1012.5,Smaller pKa releases proton easier,Residues on amino acids can release or accept protons,pKa o

8、f Amino Acid Residues,Only His has the residue with a neutral pKa (imidazole),Amino acids-COOH-NH2-R GlyG2.349.60 AlaA2.349.69 ValV2.329.62 LeuL2.369.68 IleI2.369.68 SerS2.219.15 ThrT2.6310.4 MetM2.289.21 PheF1.839.13 TrpW2.389.39 AsnN2.028.80 GlnQ2.179.13 ProP1.9910.6 AspD2.099.823.86 GluE2.199.674

9、.25 HisH1.829.176.0 CysC1.7110.88.33 TyrY2.209.1110.07 LysK2.188.9510.53 ArgR2.179.0412.48,pK1,pK1,pK2,pK2,pK3,pI,pI ?,three pKa,two pKa,?,?,pKa of Amino Acids,A+,Ao,A-,A2-,pK1 = 2.1,pK2 = 3.9,pK3 = 9.8,= 3.0,first,second,third,Isoelectric point,Isoelectric point is the average of the two pKa flanki

10、ng the zero net-charged form,Aspartic acid,OH,20種氨基酸的pI,Conclusion,pH pI 帶負電，移向正極,pH pI 帶正電，移向負極,pH = pI 不帶電，不移動,4. 氨基酸的甲醛滴定： 氨基酸能直接用酸、堿滴定來進行定量測定嗎？ pH = pKa2 + logH2NCH2COO-/H3N+CH2COO- 甲醛與H2NCH2COO- 結合, 有效地減低了后者的濃度, 所以，H2NCH2COO -/H3N+CH2 COO - 的比值總要比不存在甲醛的情況下小得多。,五氨基酸的化學反應： （一）NH3參加的反應： （二）COOH參加的

11、反應： （三）NH3 COOH的反應： （四）R基參加的反應：,（一）NH3參加的反應： 室溫下與HNO2反應（脫氨）: Van Slyke 法測定氨基氮的基礎 2. 與酰化試劑反應（在肽合成中用于NH3的保護): 氨基酸的氨基與酰氯或酸酐在弱堿溶液中發(fā)生作用時, 氨基即被?；?,?；磻?常用的酰化試劑:,與丹磺酰氯（DNS-Cl）的反應,DNS-氨基酸,用途：反應用于蛋白質的N-末端的測定。,在弱堿溶液中，氨基酸的-氨基與2,4-二硝基氟苯(DNFB) 反應，生成黃色的二硝基苯氨基酸（DNP-AA）。,此反應最初被Sanger 用于測定肽鏈 N-端氨基酸,3. 烴基化反應：FDNB、PI

12、TCEdman降解,Edman反應,4. 形成西佛堿反應：與醛反應 氨基酸的-氨基能與醛類化合物反應生成弱堿西佛堿。西佛堿是以氨基酸為底物的某些酶促反應（如：轉氨反應）的中間物。,5. 酶促脫氨基反應： 氨基酸在體內經氨基酸氧化酶催化（即脫-氨基）而轉變成酮酸。,氨基酸氧化酶,6與熒光試劑反應： 用于蛋白質的標記，修飾，游離氨的測定（Lys） 熒光胺： + RNH2 PH9，室溫 過量的熒光胺在1分鐘內被水解。,激發(fā)=390nm，發(fā)射=475nm,熒光性,鄰苯二甲醛： + RNH2 + SH-R,激發(fā)=340nm，發(fā)射=455nm,熒光性,（二）COOH參加的反應： 成鹽和成酯反應（COOH保

13、護） 當氨基酸的羧基變成甲酯、乙酯或鈉鹽后, 羧基的化學反應性能即被掩蔽羧基被保護, 而氨基的化學反應性能得到加強氨基被活化, 容易和?；驘N基結合, 這就是為什么氨基酸的?；蜔N基化需要在堿性溶液中進行的原因。,成酰氯反應（COOH活化） 氨基酸的氨基用適當的保護基（如：芐氧甲酰基）保護后, 其羧基可與二氯亞砜或五氯化磷作用生成酰氯，使氨基酸的羧基活化, 使它容易與另一氨基酸的氨基結合。,酶促脫羧和化學脫羧反應： 在體內,經氨基酸脫羧酶催化，釋放CO2，生成相應的一級胺。 在體外: NH2CHCOOH Ba(OH)2 ， RCH2NH2 + CO2 R 疊氮反應（COOH活化） 氨基酸的氨

14、基通過?；右员Ｗo, 羧基經酯化轉變?yōu)榧柞? 然后與肼和亞硝酸反應即變成疊氮化合物。此反應使氨基酸的羧基活化，用于肽的人工合成。,疊氮反應,?；被峒柞?酰化氨基酸酰肼,?；被岑B氮,反應分2步：,茚三酮反應常用于aa的定性和定量分析,（三）NH3和COOH共同參加的反應： 1. 與茚三酮反應：,Pro的茚三酮反應呈黃色, =440nm,=570nm,（三）NH3和COOH共同參加的反應： 1. 成肽反應： 一個AA的氨基與另一AA的羧基可以縮合成肽，形成的鍵稱為肽鍵。,（四）R基參加的反應： 氨基酸側鏈上的功能團也能發(fā)生化學反應，如：羥基、酚基、巰基 ( 包括二硫鍵 ) 、吲哚基、咪唑基

15、、胍基、甲硫基、非-NH3、非-COOH等。 什么是蛋白質的化學修飾 ？,（四）R基參加的反應： 1. Tyr： （1）碘化或硝化分別生成一腆Tyr、二腆Tyr、一硝基Tyr、二硝基Tyr； （2）Pauly反應：Tyr的酚基與重氮化合物 (如：對氨基苯磺酸的重氮鹽) 結合生成橘黃色的化合物，可用于鑒定Tyr。,（3）Millon反應（酚基反應）： Tyr + Hg(NO3)2 (含HNO2的HNO3溶液) 紅色化合物 （4）Follin反應（酚基和吲哚基）：可用于測定Tyr和Trp含量。 Tyr(Trp) + 磷鎢酸和磷鉬酸 還原 蘭色化合物 （5）黃色反應（苯環(huán)反應）： Tyr(Trp,

16、Phe) 濃HNO3 硝基苯衍生物（黃色）,2. His： Pauly反應：呈棕紅色 3. Arg： （1）與環(huán)已二酮反應：Arg的胍基在硼酸鈉buffer（pH8-9,25-35）中，與1，2-環(huán)已二酮反應,生成縮合物。（P140） （2）坂口反應（Sakaguchi）（胍基反應） Arg + -萘酚 紅色化合物 NaClO N2 + NaCl + H2O,4. Trp： （1）被N溴代琥珀酰亞胺氧化，此反應可用于分光光度法測定蛋白質中Trp的含量，并能在Trp和Tyr殘基處選擇性化學斷裂肽鍵。 （2） Follin反應: （3） 黃色反應: 5. Met： 碘甲烷反應（用于同位素標記）：

17、Met的甲硫基是一個很強的親核基團，可與烴化試劑（如：碘甲烷）形成锍鹽，此反應可被巰基試劑逆轉。在逆轉反應中, 原有的甲基和新加入的甲基除去的機會是相等的, 因此當用14C標記的甲基腆處理時, 獲得的Met將有 50% 是同位素標記的。,6. Cys： （1）與碘乙酸反應： Cys側鏈上的-SH, 反應性能很高, 在微堿性 pH 下, -SH 基發(fā)生解離形成硫醇陰離子（-CH2-S-）。此陰離子是-SH的反應形式, 能與鹵化烷（如：腆乙酸、腆乙酰胺、甲基腆等）迅速反應, 生成相應的穩(wěn)定烷基衍生物。 （2）與氮丙啶反應： 生成的側鏈帶有正電荷，為胰酶水解肽鏈提供了一個新的位點，在蛋白質測序中很有

18、用。 同時，此反應也可用來保護肽鏈上的-SH，以防止被重新氧化成二硫鍵。,（3）與金屬離子反應 -SH能和各種金屬離子形成穩(wěn)定程度不等的絡合物。常用的有 R-Hg+ 型的一價有機汞制劑（如：對氯汞苯甲酸）形成絡合物。 由于許多蛋白質, 如: SH 酶, 其活性中心涉及-SH, 當遇到重金屬離子而生成硫醇鹽時, 將導致酶的失活, 因此,制備這類蛋白質時應避免重金屬離子。 （4）Ellman反應（二硫硝基苯甲酸，DTNB） Cys與二硫硝基苯甲酸 (DTNB) 或稱 Ellman 試劑發(fā)生硫醇-二硫化物交換反應。 反應中 1 分子的Cys引起1分子的硫硝基苯甲酸的釋放。它在 pH 8.0 時, 在 412nm 波長處有強烈的光吸收, 因此可利用分光光度法定量測定-SH。,硫硝基苯甲酸,測定Cys含量（pH8.0，412nm的摩爾消光系數=13600）,二硫硝基苯甲酸（DTNB）,（5）氧化和還原（O2，過甲酸，巰基乙醇等） -SH很容易受空氣或其他氧化劑氧化。當有痕量的金屬離子，如：Cu2+,Fe2+,Co2+ 或 Mn2+ 存在下，-SH的空氣氧化將顯著提高。 硫醇氧化中一般遇到的只有兩種氧化產物：二硫化物和磺酸。 前者是硫醇的空氣氧化產物，例如：半胱氨酸氧化成胱氨酸，后者是在更強的氧化劑作用下產生的, 例如：用過