洛鉑抑制胃癌sgc_7901細胞增殖及其機制的初步研究_鄭磊_W

1、 軍事醫(yī)學 2013 年 8 月 第 37 卷 第 8 期 Mil Med Sci，Vol 37，No 8，Aug，2013 611 洛鉑抑制胃癌 SGC-7901 細胞增殖及其機制的初步研究 鄭 磊，高立明，付占昭，康麗影，余宗艷，畢 然，馬智慧 摘要 目的 觀察洛鉑對胃癌細胞 SGC-7901 細胞增殖的影響，并探討其作用機制。方法 將對數(shù)生長期的SGC-7901 細胞分對照組( 不加藥物) 和實驗組( 加入不同濃度洛鉑) ，采用倒置顯微鏡觀察不同濃度下細胞生長狀態(tài); MTT 法觀察對細胞的增殖抑制; Western 印跡方法分析不同濃度洛鉑對 SGC-7901 細胞內(nèi) Bcl-2 蛋白表

2、達水平的影響。結(jié)果 倒置顯微鏡下觀察，洛鉑能抑制細胞增殖，出現(xiàn)明顯的凋亡學形態(tài)特征。MTT 法顯示洛鉑能抑制細胞增殖，并呈濃度及時間依賴關(guān)系。Western 印跡結(jié)果顯示洛鉑能使 SGC-7901 細胞 Bcl-2 蛋白表達水平下降。結(jié)論 洛鉑能明顯抑制胃癌 SGC-7901 細胞增殖，誘導凋亡，可能與調(diào)節(jié) SGC-7901 細胞 Bcl-2 蛋白表達水平相關(guān)。 關(guān)鍵詞 洛鉑; 胃癌; SGC-7901 細胞; 細胞增殖; Bcl-2 中圖分類號 735 2; 979 1 文獻標志碼 A 文章編號 1674-9960( 2013) 08-0609-04 DOI: 10 7644 / j iss

3、n 1674-9960 2013 08 011 Lobaplatin inhibition of gastric cancer SGC-7901 cells proliferation and a preliminary study of its mechanism ZHENG lei，GAO Li-ming* ，F(xiàn)U Zhan-zhao，KANG Li-ying，YU Zong-yan，BI an，MA Zhi-hui ( The First Hospital of Qinhuangdao，Qinhuangdao，Hebei 066000，China) * Corresponding aut

4、hor，Tel:E-mail: tshgaoliming sina com Abstract Objective To observe the effect of lobaplatin on the proliferation of gastric cancer cell SGC-7901 and to study the mechanism Methods SGC-7901 cells in the logarithmic phase were divided into negative control group ( without drugs) and expe

5、rimental group ( adding different concentrations of lobaplatin) The inverted microscope was used to observe cell growth at different concentrations MTT method was used to observe the inhibition of the gastric cancer cell prolifera- tion Western blot was used to detect the expression of Bcl-2 in SGC-

6、7901 cells that were treated by different concentrations of lobaplatin esults Lobaplatin inhibited cell proliferation in a concentration-and time-dependencty manner Western blot results showed that Bcl-2 protein level decreased after lobaplatin treatment Conclusion Lobaplatin could significantly inh

7、ibit gastric cancer SGC-7901 cell proliferation and induce apoptosis，possibly related to the regulation of Bcl-2 protein expression Key words lobaplatin; gastric cancer; SGC-7901 cells; cell proliferation; Bcl-2 胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，據(jù)最新統(tǒng)計， 我國每年新發(fā)胃癌患者達 40 萬人 達 30 萬人。我國胃癌死亡率居高不下，占全部腫瘤死亡率1 /5，僅次于肺癌?；熢谖赴┑闹委熤?/p>

8、占有重要地為乳腺癌、小 細胞肺癌和慢性粒細胞性白血病( CML) 。研究表明，除上述適應癥以外，洛鉑在復發(fā)性卵巢癌、食道癌、鼻咽癌、淋巴瘤及 腫瘤等方面也初步顯示出較好療效，值得深入研究和試用3。位，但是胃癌的化療至今未確定標準化療方 案1。 因為洛鉑對胃癌 SGC-7901 細胞的基礎(chǔ)研究相關(guān)文洛鉑( lobaplatin，LBP) 是第 3 代鉑類藥物，抗腫瘤效果與順鉑( DDP) 的作用相當或更好，毒性較 DDP 小而無交叉耐藥2。SFDA 批準的洛鉑適應癥 作者簡介 鄭 磊，男，碩士研究生，研究方向: 消化道腫瘤治療， Tel:E-mail: applebro

9、ther 163 com 作者單位 秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島 066000 通訊作者 高立明，Tel:E-mail: tshgaoliming sina com 獻較少，本研究選取 LBP 作用于人胃癌 SGC- 7901 細胞，目的是在基礎(chǔ)水平初步探索其可能的作用機制， 從而為 LBP 是否可在胃癌化療中的應用及提高化療療效提供相應的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。 1 材料與方法 1 1 材料 1. 1 1 細胞株 人胃癌SGC-7901 細胞株購買于中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫。 1. 1 2 藥物 洛鉑凍干粉劑( LBP) 為海南長安國際制藥有限公司產(chǎn)品。 1 1 3 試

10、劑 四甲基氮唑藍( MTT) 、胰蛋白酶、 Bcl-2 及 -actin 抗體均為美國 Sigma 公司產(chǎn)品; 二 甲基亞砜( DMSO) 購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限 公司; 辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京中杉金橋公司; PMI1640 培養(yǎng)基為 Gibco 公司產(chǎn)品; 10% 優(yōu)級胎牛血清為杭州四季青產(chǎn)品。 1 1 4 儀器 CO2 電熱恒溫培養(yǎng)箱( 日本 SANYO 公司) ，倒置顯微鏡( 日本 OLYMPUS) ，酶標儀( 上海 科華公司) ，DYCP-31B 型電泳槽( 北京六一儀器 廠) ，DYY-2 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀( 美國 BD 公司) ， HP-8453 紫外 可見分光光度

11、計( 美國 Pharmacia Biotech) 。 1 2 方法 1 2 1 細胞培養(yǎng) 人胃腺癌 SGC-7901 細胞用含 10% 胎牛血清的 PMI1640 培養(yǎng)基，在 5% CO2 、 37 飽和濕度的培養(yǎng)箱中，2 3 d 用 0 25% 胰蛋白酶消化傳代一次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。 1. 2 2 倒置顯微鏡下觀察 取對數(shù)期生長的 SGC- 7901 細胞，制成濃度為1 105 個/ ml 的細胞懸液，接種于 3 塊 96 孔培養(yǎng)板中( 外孔加蒸餾水，中間 60 孔加細胞用于實驗) ，每孔細胞數(shù)約 5000 個，置入CO2 電熱恒溫培養(yǎng)箱中24 h。24 h 后將培養(yǎng)液吸出，將 6

12、0 孔分為 6 組，第 1 組為 對照組( 加入上述方法制備的細胞懸液 200 l) ，第 2 6 組為實 驗組，用培養(yǎng)基使 LBP 終濃度分別為 0 625、1 25、 2. 5、5、10 g / ml。每個濃度設6 復孔，于37 、5% CO2 飽和濕度條件下分別培養(yǎng) 24、48 和 72 h。分別在鏡下觀察 LBP 對胃癌細胞生長的影響。 1 2 3 噻唑藍比色法( MTT) 計算細胞抑制率 取對數(shù)生長期的 SGC-7901 細胞，每孔 5000 個分別接種于 3 個 96 孔板( 24 h 板、48 h 板、72 h 板) ，每孔總?cè)莘e達 200 l，各設 6 復孔。分設 對照組、 L

13、BP 組( 設 6 個濃度: 0 3125、0 625、1 25、2 5、5、10 g / ml) 。細胞經(jīng)含 10% 優(yōu)級胎牛血清的 PMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h，細胞貼壁生長良好時，吸取原液，按設置的分組條件加入 LBP 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，3 個 孔板分別在 24、48、72 h 后在各孔加入5 mg / ml MTT 20 l，繼續(xù)孵育 4 h 后棄原液，各孔加入標準濃度的 二甲基亞砜( DMSO) 200 l 終止，震蕩 15 min，酶標 儀 490 /630 nm 雙波長檢測光密度值。計算( 24、48、72 h) 各藥物濃度下 SGC-7901 細胞抑制率。公式: 細胞抑制

14、率( % ) = ( 1 實驗組吸光度/ 對照組吸光度) 100% 。 1 2 4 Western 印跡法檢測 取對數(shù)生長期的胃癌 SGC-7901 細胞，制成濃度為 1 105 個/ ml 的細胞懸液，接種于 6 孔培養(yǎng)板中，實驗共分為 6 組，第 1 組為 對照組，第 2 6 組為實驗組，各加入 LBP 終濃度分別為 0 625、1 25、2 5、5、10 g / ml 的溶液 2 ml 于 37 、5% CO2 條件下培養(yǎng) 48 h，吸取原培養(yǎng)液，PBS 重復洗滌離心 2 次。吸盡上清后，每孔加 200 l 細胞裂解液( 含 PMSF) 在冰上裂解 30 min， 12 000 r /

15、min 離心 5 min，取上清至于離心管中。分 別加入等量 2 SDS-PAGE 上樣緩沖液，沸水加熱3 5 min。上樣于 12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS- PAGE 電泳) 。電泳直至溴酚蘭到達分離膠底部。電泳后的凝膠切除積層膠，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡30 min 左右。取出后由下至上將 3 層濾紙、膜、凝膠及 3 層濾紙依次放好( 硝酸纖維素膜用前需在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 10 15 min，濾紙用前在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸 濕，避免產(chǎn)生氣泡) 。將其置于轉(zhuǎn)膜槽中，凝膠一側(cè)置于陰極，打開電泳儀，調(diào)電流 160 mA，轉(zhuǎn)膜3 h 后關(guān)閉電源。取出膜在蒸餾水中漂洗 3 次。將膜置于封閉液中 4 封

16、閉 12 h。封閉過夜的膜用蒸餾水漂洗后，用 TBST 洗 4 次( 10 min / 次) ，加入一抗( 1 500 稀釋) ，放入膜，室溫下于搖床孵育 2 h，棄去一抗，蒸餾水洗膜 1 次，在搖用 TBST 洗 4 次( 10 min / 次) ，加入二抗( 1 1000 稀釋) ，室溫下于搖床孵育 1 h，用 TBST 洗 4 次( 10 min / 次) ，蒸餾水洗凈。加入底物顯色液顯色后，放入蒸餾水終止 顯色，記錄結(jié)果。 1. 2 5 統(tǒng)計學處理 MTT 法所測抑制率以 x珋 s 表示，采用 SPSS17 0 軟件處理數(shù)據(jù)，兩組均數(shù)比較采用 t 檢驗，不同濃度不同時間采用重復測量方差

17、分析。不同濃度抑制率給予廣義線性趨勢檢驗，以 P 0 05為具有統(tǒng)計學意義。 2 結(jié)果 2. 1 倒置顯微鏡下觀察對SGC-7901 細胞形態(tài)的影響未經(jīng)藥物處理的 SGC-7901 細胞大小均一，細胞核均勻，呈多邊形貼壁生長。倒置顯微鏡下低濃度LBP( 0 625 g / ml) 作用24 h 后可見極少量SGC- 7901 細胞變圓、體積增大，大部分細胞仍貼壁生長， 作用 48、72 h 后，細胞變化不大。中等濃度 LBP ( 5 g / ml) 作用 24 h 后可見變圓細胞逐漸增多，貼壁生長細胞數(shù)量減少，脫壁漂浮的小圓球細胞及細 胞碎片逐漸增多，48 h 可見變圓細胞較前增多，貼壁生長細

18、胞減少，漂浮的小圓球細胞和細胞碎片增多，72 h 后可見大部分細胞呈凋亡小體樣改變。高濃度 LBP( 10 g / ml) 作用 24、48、72 h 均為凋亡細胞樣改變( 圖 1) 。 圖 1 不同濃度洛鉑作用于 SGC-7901 細胞 24、48、72 h 后倒置顯微鏡觀察( 400) A 對照組; B、C、D 0 625 g / ml 洛鉑 24、48、72 h; E、F、G 5 g / ml 洛鉑 24、48、72h; H、I、J 10 g / ml 洛鉑 24、48、72 h 2 2 LBP 對胃癌 SGC-7901 細胞增殖的影響 根據(jù)實驗及相關(guān)統(tǒng)計結(jié)果，在 48、72 h 下，隨

19、LBP 濃度的升高對 SGC-7901 抑制作用增強( P 0 05) ，但 3 個時間段經(jīng)線性趨勢檢驗，均呈上升趨勢( P 0 01) ，相同濃度下，隨 LBP 作用時間的延長而明顯受到抑制( P 0 05) ( 表 1，圖 2) 。 表 1 不同濃度洛鉑作用不同時間對 SGC-7901 細胞抑制率( % ，x珋 s) 濃度 g / ml 時間( t / h) 24 4872 0 3125 7 022 0 783 6 781 1 017 5 111 0 907 0 625 6 496 1 763 7 237 2 167 9 121 1 798 1 25 7 021 1 000 10 011

20、0 985 18 615 0 376 2 5 7 022 0 183 29 973 0 776 53 651 0 781 5 14 617 2 918 61 609 1 002 92 343 0 754 10 67 035 0 793 94 051 2 808 95 637 2 001 圖 2 不同濃度 LBP 作用胃癌細胞 SGC-7901 的抑制作用1 0 3125 g / ml; 2 0 625 g / ml; 3 1 25 g / ml; 4 2 5 g / ml; 5 5 g / ml; 6 10 g / ml 2 3 Western 印跡檢測 Bcl-2 蛋白的表達 對結(jié)果進行灰度

21、值分析，6 組 SGC-7901 的 Bcl - 2 蛋白灰度值逐漸降低?？梢婋S LBP 濃度的增高， 凋亡率亦增高，Bcl-2 的表達逐漸降低。提示 LBP 誘導的細胞凋亡與 Bcl-2 蛋白的表達有一定關(guān)系 ( 圖 3) 。 3 討論 圖 3 不同濃度 LBP 作用于 SGC-7901Bcl-2 蛋白的表達情況 1 對照組; 2 0 625 g / ml; 3 1 25 g / ml; 4 2 5 g / ml; 5 5 g / ml; 6 10 g / ml P-tAG 鏈內(nèi)交叉連接，阻礙 DNA 的復制和轉(zhuǎn)錄過程，從而干擾腫瘤細胞周期4。2002 年海南長安國際制藥有限公司從德國 AS

22、TA 公司購買洛鉑在中國的專利權(quán)及生產(chǎn)銷售權(quán)，2005 年 3 月經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局( SFDA) 批準洛鉑作為國家一類新藥上市。 胃癌主要的治療方法包括外科手術(shù)、放療和化療，但多數(shù)確診的患者都屬胃癌中晚期，單純手術(shù)治療的效果往往不太理想，化療是胃癌治療的常用方法?；煼桨钢秀K類藥物為最有效的化療藥物之一，目前胃癌化療常用鉑類藥物有順鉑、奧沙利鉑、卡鉑等。洛鉑是第三代鉑類抗癌藥物，有研究證實對于晚期胃癌，洛鉑聯(lián)合替加氟有效率優(yōu)于奧沙利鉑聯(lián)合替加氟5。但洛鉑應用于胃癌細胞基礎(chǔ)研究的相關(guān)文獻較少。 Bcl-2 基因包括作用相反的 2 個亞類，促進細胞凋亡的 bax 等基因和抑制細胞凋亡的 B

23、cl-2 等基因6。Bcl-2 主要功能是發(fā)現(xiàn)、登記和評價細胞內(nèi)的損傷，整合相互矛盾和競爭信號，發(fā)出細胞命運的指令，作為抗凋亡基因，它不是通過加速細胞的有絲分裂，而是延長其生存期7。研究表明 Bax 和 Bcl-2在異型性增生及癌組織中的表達遠高于炎 變組織，證實癌變前及胃癌發(fā)生早期即可出現(xiàn) Bax 和Bcl-2 表達異常。且 Bcl-2 在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起LBP ASTA 3著重要的作用8。 是由德國公司開發(fā)研制的第代鉑類抗腫瘤藥物，其作用機制是通過形成 P-tGG 和 ( 下轉(zhuǎn)第 614 頁) 頭燙或者徒手拍打，使螞蟥自然死亡或掉落，或者直接用衣服擠壓螞蟥致死。這些方法都能起到一定作用

24、，但不能徹底解決問題。例如巡邏返程后，大多數(shù)被螞蟥叮咬者仍被繼續(xù)叮咬。叮咬后的傷口 不止，常用藥物通常是紅花油、風油精、乙醇等刺激性藥物，人員反映不佳。 螞蟥的 主要為咬傷后失血7。本次調(diào)查結(jié)果顯示，巡邏人員在調(diào)查區(qū)域內(nèi)受螞蟥叮咬較為嚴重，人誘法螞蟥密度達到 7 1 條/ ( 15 min人) ;螞蟥叮咬還可對人員心理產(chǎn)生不良影響，螞蟥引起人員心理恐懼的占 70% ; 被叮咬率 61% ，其中野外巡邏時被咬率為 100% 。 對螞蟥的藥物驅(qū)避和現(xiàn)場防治初步結(jié)果顯示， 吡啶生物堿、苦參堿和聯(lián)苯菊酯 3 種藥物均有效果， 使用藥物對作訓服進行噴霧處理后，與對照組相比， 吡啶生物堿、苦參堿、聯(lián)苯菊酯

25、 3 組人員對螞蟥的驅(qū)避率分別為 87 2% ，74 4% 和 66 7% ; 顯示出藥物具 有明顯的驅(qū)避效果，30 min 后在吡啶生物堿組、苦 參堿組的衣物上附著的螞蟥取下后觀察，死亡率分別為100% 和 50% 。以吡啶生物堿防治螞蟥效果最佳。 【參考文獻】 1 譚恩光，梁傳精 不同農(nóng)藥對海南山蛭的毒力測定及其應用研究J 應用生態(tài)學報，2001，12( 2) : 266 268 2 楊 潼 七種殺蟲劑對兩種常見水蛭急性毒性效應的研究 J 中國環(huán)境科學，1989，9( 1) : 51 55 3 楊 潼 中國動物志環(huán)節(jié)動物門蛭綱M 北京: 科學， 1996: 263 4 楊振洲，石 華，史惠

26、勤，等 FGT-A 型便攜式野外媒介生物標本采集保存運輸檢測系統(tǒng)的研制與應用J 中國媒介生物學及控制雜志，2008，19( 6) : 584 586 5 石 華，楊振洲，史惠勤 手持全球定位儀系統(tǒng)在疾病媒介標本采集中的應用J 衛(wèi)生殺蟲藥械，2009，15( 2) : 152 154 6 楊振洲，儲宸一，黃清臻，等 林芝地區(qū)螞磺的生態(tài)學調(diào)查J 軍事醫(yī)學，2012，36( 8) : 613 615 7 張志文 山螞蟥叮咬傷的防治J 中國蛇志雜志，1996，8 ( 4) : 49 ( 楊兆弘 編輯2012 12 19 收稿) ( 上接第 611 頁) 本研究以胃癌細胞株 SGC-7901 為模型，通

27、過倒置顯微鏡觀察證實，洛鉑處理的 SGC-7901 細胞有明顯的凋亡特征。MTT 結(jié)果表明，洛鉑對體外培養(yǎng)的人胃癌 SGC-7901 細胞有顯著的生長抑制作用，抑制率呈現(xiàn)時間濃度依賴性，在 72 h、10 g / ml濃度作用下呈現(xiàn)最高抑制率( 95 637% ) 。應用 Western 印跡法檢測胃癌 SGC-7901 細胞 Bcl-2 蛋白表達，說明洛鉑可使 Bcl-2 蛋白表達下降。總體顯示洛鉑對胃癌細胞有很明顯的抑制作用。 綜上所述，LBP 作為新研制的一種鉑類復合物，具有較強的抗腫瘤活性的作用，可顯著抑制胃癌細胞 SGC-7901 的體外增殖，引起細胞增殖抑制， 誘導細胞凋亡。本實驗僅探討了 LBP 單藥對胃癌細胞株 SGC-7901 的抑制作用，LBP 是否優(yōu)于其他鉑 類，是否可與其他藥物聯(lián)合治療胃癌，是否有協(xié)同作用等都有待進一步研究。 【參考文獻】 1 Crew KD，Neugu