11DNA重組技術(shù)的基本工具20101115.ppt

1、人教版選修3現(xiàn)代生物科技專題,目 錄,專題1 基因工程 專題2 細(xì)胞工程 專題3 胚胎工程 專題4 生物技術(shù)的安全性和倫理問(wèn)題 專題5 生態(tài)工程,選修3 核心知識(shí)關(guān)系,現(xiàn)代生物科技專題,科學(xué) 技術(shù),現(xiàn)代,基因工程 細(xì)胞工程 胚胎工程 生態(tài)工程,基本概念和基本原理,技術(shù)流程、操作和應(yīng)用,倫理問(wèn)題,生物技術(shù)的安全性與倫理問(wèn)題,社會(huì),交流、討論、辯論,基因工程 細(xì)胞工程 胚胎工程 生態(tài)工程,分子水平,細(xì)胞水平,個(gè)體水平,群體水平,微觀,宏觀,中觀,各專題之間知識(shí)難度差異較大。,專題的安排是微觀中觀宏觀。,本模塊知識(shí)內(nèi)容的構(gòu)建順序：,致同學(xué)們生物科技創(chuàng)造美好未來(lái) 由領(lǐng)導(dǎo)和組織我國(guó)有關(guān)基因組測(cè)序工作的楊

2、煥明教授撰寫。給學(xué)生生物科學(xué)技術(shù)歷史的凝重感和生物科學(xué)技術(shù)工作者的社會(huì)責(zé)任感以感染，而“生命是數(shù)據(jù)的”的提示，更洋溢著時(shí)代氣息。,序言：,專題引言、題圖和文字,科技探索之路,基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程 細(xì)胞工程的發(fā)展歷程 胚胎工程的建立 生物技術(shù)引發(fā)的社會(huì)爭(zhēng)論 生態(tài)工程的興起,編寫目的： 概述本領(lǐng)域的發(fā)展歷程，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。 介紹一些背景資料或呈現(xiàn)一些不同的觀點(diǎn)，以激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣。 加深學(xué)生對(duì)科學(xué)史和科學(xué)本質(zhì)的理解和認(rèn)識(shí)，增強(qiáng)學(xué)生對(duì)科學(xué)、技術(shù)與社會(huì)關(guān)系的理解。,專題1 基因工程,專題1 基因工程,本專題的內(nèi)容由題圖、科技探索之路和四節(jié)內(nèi)容構(gòu)成。,題圖為學(xué)習(xí)者創(chuàng)設(shè)了一個(gè)意境。沃

3、森和克里克對(duì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的重大發(fā)現(xiàn)和隨后的技術(shù)創(chuàng)新孕育了基因工程。在復(fù)制的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)上展示的轉(zhuǎn)基因工程菌、牛、羊、魚、番茄、甜椒、牽牛等，代表了基因工程在三個(gè)重要方面的研究成果：轉(zhuǎn)基因微生物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因植物。在上述畫面的基礎(chǔ)上，點(diǎn)出基因工程的主題：“基因工程是按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?！贝祟}圖不僅寓意深刻，且十分生動(dòng)。,科技探索之路-基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程是正文的前奏曲。沒(méi)有基礎(chǔ)理論的研究成果，沒(méi)有技術(shù)方面的創(chuàng)新發(fā)明，基因工程不可能誕生，也不可能迅速崛起。其

4、內(nèi)容分為兩部分：一部分介紹基礎(chǔ)理論研究成果，一部分介紹在技術(shù)層面上發(fā)明的各種操作手段。編者精選這些最重要的成果，其目的是使學(xué)生從科技史實(shí)中，感悟創(chuàng)新是科學(xué)技術(shù)發(fā)展的不竭動(dòng)力。,基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程,20世紀(jì)中葉，基礎(chǔ)理論取得了重大突破 DNA是遺傳物質(zhì)的證明 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立 遺傳密碼的破譯,1.基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn) 2.工具酶的發(fā)現(xiàn) 3.DNA合成和測(cè)序技術(shù)的發(fā)明 4.DNA體外重組的實(shí)現(xiàn) 5.重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功 6.第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問(wèn)世 7.PCR技術(shù)的發(fā)明,技術(shù)發(fā)明使基因工程的實(shí)施成為可能,問(wèn)題探討：,蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。 讓細(xì)菌

5、的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。,普通棉花抗蟲棉,1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具,想一想：需要做哪些關(guān)鍵工作？,基因工程培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過(guò)程：,普通棉花(無(wú)抗蟲特性),蘇云金桿菌,提取,抗蟲基因,與運(yùn)載體DNA拼接 導(dǎo)入,棉花細(xì)胞(含抗蟲基因),棉花植株(有抗蟲特性),上述培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟是什么？,1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具,基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：,關(guān)鍵步驟一：,從蘇云金桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出抗蟲基因,關(guān)鍵步驟二：,抗蟲基因與運(yùn)載體DNA拼接,關(guān)鍵步驟三：,抗蟲基因?qū)胧荏w(棉花)細(xì)胞,1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具,解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些

6、工具？,“分子手術(shù)刀” 限制性核酸內(nèi)切酶,“分子縫合針” DNA連接酶,“分子運(yùn)輸車” 基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體,1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具,一、限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀”,來(lái)源：,主要從原核生物中分離純化出來(lái)。,種類：,已從近300種微生物中分離出約4000種限制酶。,作用：,1.能識(shí)別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列 2.使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。,具有特異性。 一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子，,作用特點(diǎn)：,大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成 少數(shù)的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成,限制酶的識(shí)別序列：,一、限制

7、性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀”,形成兩種末端,EcoRI限制酶的切割：,SmaI限制酶的切割,要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？,要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。,如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？,會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來(lái)，就似乎可以合成重組的DNA分子了。,思考?,DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?,1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵,形成磷酸二酯鍵,1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵,2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接成

8、一條互補(bǔ)的DNA鏈,2)將DNA雙鏈上的缺口同時(shí)連接起來(lái)，不需要模板,二、DNA連接酶“分子縫合針”,二、DNA連接酶“分子縫合針”,1、作用：,形成磷酸二酯鍵,恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。,2、類型：,EcoliDNA連接酶,T4DNA連接酶,來(lái)源,功能,大腸桿菌,T4噬菌體,恢復(fù) 磷酸 二酯鍵,只能連接黏性末端,能連接黏性末端和平末端(效率較低),相同點(diǎn),差別,二、DNA連接酶“分子縫合針”,可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，,Ecoli DNA連接酶或T4DNA連接酶,即恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵,T4 DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)

9、，但效率較低,T4DNA連接酶,三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體 “分子運(yùn)輸車”,1、假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？,導(dǎo)入受體細(xì)胞的目的基因不能復(fù)制，將在細(xì)胞增殖中丟失。,2、作為載體沒(méi)有切割位點(diǎn)將怎樣？,3、目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何去察覺(jué)？,如果載體上有遺傳標(biāo)記基因，在載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，就可通過(guò)標(biāo)記基因的表達(dá)來(lái)檢測(cè)。,4、如果載體對(duì)受體細(xì)胞有害將怎樣？不能分離會(huì)怎樣？,載體對(duì)受體有害，將影響受體細(xì)胞的新陳代謝，進(jìn)而使轉(zhuǎn)入的目的基因也無(wú)立足之地。載體不能分離，就不能獲得更多帶有目的基因的載體。,載體沒(méi)有切割位點(diǎn)，外源的目的基因不可能插入。,將外源基因送入受體細(xì)胞。,載體的作用：

10、,三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體 “分子運(yùn)輸車”,作為載體的必要條件：,有切割位點(diǎn)供外源DNA片段(基因)插入。 能自我復(fù)制并能帶著插入的目的基因一起復(fù)制 有遺傳標(biāo)記基因供重組DNA的鑒定和選擇。 載體DNA必需是安全的不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。 載體DNA分子大小應(yīng)適合以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。,實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。,質(zhì)粒：,裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。,三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體 “分子運(yùn)輸車”,質(zhì)粒,質(zhì)粒

11、：,能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制,有切割位點(diǎn),有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別。,三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體 “分子運(yùn)輸車”,說(shuō)明沒(méi)有危害，大腸桿菌是非致病菌，且分裂快，也便于從大量復(fù)制個(gè)體中分離出來(lái)。,質(zhì)粒 噬菌體的衍生物 動(dòng)植物病毒等,載體的種類：,三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體 “分子運(yùn)輸車”,小結(jié),隨堂練習(xí),1、關(guān)于限制酶的說(shuō)法中，正確的是（ ） A、限制酶是一種酶，只識(shí)別GAATTC堿基序列 B、EcoRI切割的是GA之間的氫鍵 C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA D限制酶只存在于原核生物中,答案：C,2. （多選）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是 A

12、、基因工程技術(shù)能定向地改造生物的遺傳性狀，培育生物新品種 B、重組DNA的形成在細(xì)胞內(nèi)完成 C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞 D、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體,答案：BD,3、不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是 A、能復(fù)制 （ ） B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn) C、具有標(biāo)記基因 D、它是環(huán)狀DNA,答案：D,20世紀(jì)中葉，基礎(chǔ)理論取得了重大突破,科技探索之路,艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體。,BACK,科技探索之路,沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。,20世紀(jì)中葉，基礎(chǔ)理論取得了重大突破,科技探索之路,梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復(fù)制,20世紀(jì)中葉，基礎(chǔ)理論

13、取得了重大突破,科技探索之路,克里克等提出中心法則,20世紀(jì)中葉，基礎(chǔ)理論取得了重大突破,BACK,科技探索之路,1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實(shí)驗(yàn)加以證明。,20世紀(jì)中葉，基礎(chǔ)理論取得了重大突破,BACK,限制酶的識(shí)別序列：,BACK,磷酸二酯鍵：,磷酸二酯鍵：,一個(gè)核苷酸脫氧核糖上第3位的羥基與下一個(gè)核苷酸脫氧核糖上第5位的磷酸羥基脫水縮合成酯鍵，該酯鍵稱3,5磷酸二酯鍵。,BACK,限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？ 限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線,中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。 圖1-1 限

14、制酶識(shí)別序列的中心軸線,BACK,切割DNA分子時(shí)產(chǎn)生的兩種不同末端,BACK,EcoRI限制酶的切割：,中軸線,黏性末端,黏性末端,在G與A之間切割,大腸桿菌的一種限制酶(EcoR)只能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。,EcoR ,黏性末端,黏性末端,EcoR,黏性末端,黏性末端,大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。,限制酶,什么叫黏性末端？,限制酶,什么叫黏性末端？,什么叫黏性末端？,被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。,BACK,中軸線,SmaI限制酶的切割：,平末端,平末端,只能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切開(kāi)。,Sma ,平末端平末端,什么叫平末端？,當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。,BACK,三 模擬操作：重組DNA分子的模擬操作,注意：這兩條DNA分子的堿基對(duì)不是隨意亂寫