《基因組學(xué)》PPT課件.ppt

1、第十三章基因組學(xué),第十三章基因工程和基因組學(xué),第一節(jié) 基因組學(xué) 概述,基因組學(xué)(genomics) ：遺傳學(xué)研究進(jìn)入分子水平后發(fā)展起來(lái)的一個(gè)分支，主要研究生物體內(nèi)基因組的分子特征。* 研究對(duì)象：以整個(gè)基因組為研究單位，而不以單個(gè)基因?yàn)閱挝蛔鳛檠芯繉?duì)象。* 研究目標(biāo)：認(rèn)識(shí)基因組的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化；闡明整個(gè)基因組所包含的遺傳信息和相互關(guān)系；充分利用有效資源，預(yù)防和治療人類疾病。,基因組(Genome)：又稱染色體組，是指一個(gè)物種單倍體的染色體數(shù)目，是生物體全部遺傳物質(zhì)的總和。 基因組學(xué)(Genomics)：對(duì)生物體所有基因進(jìn)行基因組作圖(包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜)、核苷酸序列分析、基因定位

2、和基因功能分析的一門科學(xué)。 最終目標(biāo)：獲得生物體全部基因組序列，注解基因組所含的全部基因，鑒定所有基因的功能及基因間相互作用關(guān)系，并闡明基因組的復(fù)制及進(jìn)化規(guī)律。,一、基因組學(xué)的概念,不同生物基因組大小,1. 人類基因組計(jì)劃 與曼哈頓原子 計(jì)劃、阿波羅登月計(jì)劃并稱的人類科學(xué)史上的重大工程。于1990年首先在美國(guó)啟 動(dòng)，后有德、日、英、法、中等國(guó)的科學(xué)家先后正式加入。,（一） 人類基因組, 1990年，美國(guó)國(guó)會(huì)批準(zhǔn)美國(guó)的“人類基因組計(jì)劃”在10月1日正式啟動(dòng)。其總體規(guī) 劃是準(zhǔn)備在15年內(nèi)（19902005）至少投入30億美元，分析人類的基因組30 億個(gè)堿基對(duì)。 2003年，6國(guó)科學(xué)家宣布人類基因組

3、序列圖繪制成功，HGP的所有目標(biāo)全部實(shí)現(xiàn)。覆蓋人類基因組所含基因區(qū)域的99%，精確率達(dá)到99.99%，比原計(jì)劃提前兩年多，耗資27億美元。,人類基因組計(jì)劃,人類基因組 核基因組DNA的總長(zhǎng)約3109bp，含有24條線性DNA分子，最長(zhǎng)的有250 Mb，最短的55 Mb。 30億個(gè)堿基對(duì)。 線粒體基因組是長(zhǎng)度為16569 bp的環(huán)狀DNA分子，每個(gè)細(xì)胞平均含有800個(gè)線粒體，每個(gè)線粒體含10個(gè)基因組拷貝。 以每10cm 書寫60個(gè)字母計(jì)算，30億個(gè)堿基對(duì)連接的長(zhǎng)度可達(dá)5 000 km，相當(dāng)于北京到香港來(lái)回的距離。,為人類的基因組研究提供重要的依據(jù)。 1996年，酵母菌基因組測(cè)序。 1998年12

4、月，線蟲完整基因組序列的 2000年3月，果蠅的基因組測(cè)序 2001年12月14日，擬南芥基因組的完整圖譜。,（二） 其他生物基因組,我國(guó)超級(jí)雜交稻（秈稻）基因組計(jì)劃 2001年7月啟動(dòng) 2002年4月5日Science。 材料：秈稻“9311”。 完成單位：華大基因研究中心、中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所等12個(gè)單位。 水平：水稻基因組的總基因數(shù)約為4602255615個(gè)，工作框架圖序列已覆蓋水稻整個(gè)基因組92以上的基因。 方法：“鳥槍射擊法”，利用國(guó)產(chǎn)曙光2000、曙光3000超級(jí)計(jì)算機(jī)(1000億次/秒)對(duì)隨機(jī)DNA碎片進(jìn)行排序和組裝。,水稻基因組計(jì)劃,國(guó)際水稻（粳稻）基因組計(jì)劃始于199

5、8年，日本、美國(guó)、中國(guó)、法國(guó)等國(guó)家和地區(qū)參加。中國(guó)負(fù)責(zé)第4號(hào)染色體：36 Mb (占910%)。,國(guó)際水稻基因組測(cè)序計(jì)劃,2002年12月21日Nature，中國(guó)第四號(hào)染色體。 材料：粳稻“日本晴”。 完成單位：中科院國(guó)家基因研究中心等4家單位。 水平：第四號(hào)染色體中的總堿基數(shù)目為0.35億堿基對(duì)，覆蓋全長(zhǎng)序列98的區(qū)域，只剩下7個(gè)小空洞，堿基序列的精確度達(dá)到99.99%。完整測(cè)定的著絲粒序列在高等生物中屬于首次。,國(guó)際水稻基因組測(cè)序計(jì)劃,水稻是第一個(gè)完成基因組全序列測(cè)定的農(nóng)作物，核基因組含有12條染色體，總長(zhǎng)約389Mb，1號(hào)染色體最大為43.2Mb，10號(hào)染色體最小22.6Mb。全基因組預(yù)

6、測(cè)約含有4萬(wàn)個(gè)基因。 水稻雙鏈閉環(huán)線粒體基因組大小為491kb，葉綠體基因組134.5kb,C值：是指一個(gè)單倍體基因組中DNA的總量。 值悖理 （C value paradox）：物種的C值和它的進(jìn)化復(fù)雜性之間無(wú)嚴(yán)格對(duì)應(yīng)關(guān)系的現(xiàn)象稱為C 值悖理，是復(fù)雜生物基因組的一個(gè)普遍特征,（三） C值悖理和N值悖理,（三） C值悖理和N值悖理,N值：是指生物體所含有的基因數(shù)目。 N值悖理（N value paradox）：復(fù)雜性不同的生物種屬所具有的基因數(shù)目與其生物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性不成比例的現(xiàn)象。 如結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單的線蟲含有的基因數(shù)為1.9萬(wàn)個(gè), 比線蟲更復(fù)雜的果蠅基因數(shù)為1.8萬(wàn)個(gè), 水稻的基因數(shù)約4萬(wàn)個(gè),

7、最復(fù)雜的人類其基因總數(shù)約3萬(wàn)個(gè)。,四、基因組學(xué)研究?jī)?nèi)容,（一）結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural genomics) 通過(guò)基因作圖、核苷酸序列分析確定基因組成、進(jìn)行基因定位的科學(xué)。 遺傳信息在染色體上,但染色體不能直接用來(lái)測(cè)序,必須將基因組這一巨大的研究對(duì)象進(jìn)行分解,使之成為較易操作的小的結(jié)構(gòu)區(qū)域,這個(gè)過(guò)程就是基因作圖。完成基因組圖譜構(gòu)建之后，就可以利用圖譜進(jìn)行基因組序列測(cè)定和組裝。,四、基因組學(xué)研究?jī)?nèi)容,（二）功能基因組學(xué)(functional genomics) 利用結(jié)構(gòu)基因組所提供的信息和產(chǎn)物，研究基因組功能表達(dá)的一門分支學(xué)科。 主要研究?jī)?nèi)容: 基因的識(shí)別、鑒定和克隆。包括新策略、新技術(shù)

8、、新方法的創(chuàng)立和各種基因組數(shù)據(jù)的建立； 基因結(jié)構(gòu)與功能及其相互關(guān)系的研究。包括基因變異體的系統(tǒng)鑒定和目錄的繪制；基因表達(dá)譜的編制、基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的鑒定、基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的編制； 基因表達(dá)調(diào)控的研究,四、基因組學(xué)研究?jī)?nèi)容,（三）蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics) 研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動(dòng)規(guī)律。旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式,內(nèi)容包括鑒定蛋白質(zhì)表達(dá)、存在方式、結(jié)構(gòu)、功能和相互作用方式等。 基因是遺傳信息的攜帶者,而全部生物功能的執(zhí)行者卻是蛋白質(zhì), 僅僅從基因的角度來(lái)研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。,第 2節(jié) 基因組圖譜構(gòu)建,基因組計(jì)劃的目的是獲得全基因組序列，并對(duì)其進(jìn)行解讀。DNA測(cè)序每

9、次反應(yīng)僅能讀取1000bp的長(zhǎng)度，因此，基因組測(cè)序的基礎(chǔ)是基因組圖譜的構(gòu)建。,鳥槍射擊法(shotgun) 基因組序列測(cè)定,第 2節(jié) 基因組圖譜構(gòu)建,基因組測(cè)序策略 重疊群法 相互存在重疊序列的一組克隆。根據(jù)重疊群的相對(duì)位置講各個(gè)克隆首尾相連，長(zhǎng)度可達(dá)百萬(wàn)級(jí)bp。對(duì)單個(gè)重疊群，采用鳥槍法測(cè)序，然后進(jìn)行組裝。這是由上而下（up to down）的測(cè)序策略。 直接鳥槍法 首先進(jìn)行全基因組鳥槍法測(cè)序，再用分子標(biāo)記為起點(diǎn)強(qiáng)鳥槍DNA片段組裝。這是由下而上（bottom to up）的測(cè)序策略。這種方法依賴于高密度分子標(biāo)記基因組圖譜。 基因組圖譜分為遺傳圖譜和物理圖譜。,（一）遺傳標(biāo)記,遺傳標(biāo)記就是遺傳

10、物質(zhì)的特殊的易于識(shí)別的多態(tài)性表現(xiàn)形式，它包括形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記。 形態(tài)標(biāo)記：主要指可以觀察到的一些性狀,如種皮顏色、眼色、株高等。 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記：細(xì)胞學(xué)標(biāo)記是指能明確顯示遺傳多態(tài)性的細(xì)胞學(xué)特征。 生化標(biāo)記：主要是同工酶及種子貯藏蛋白，有時(shí)又稱蛋白質(zhì)標(biāo)記。 分子標(biāo)記：主要指DNA水平上的標(biāo)記。,DNA標(biāo)記,以DNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記主要包括 基于雜交的分子標(biāo)記，如RFLP。 基于PCR的分子標(biāo)記，如RAPD、AFLP、SSR (又稱microsatellite )、AFLP 等。 基于DNA序列和芯片的分子標(biāo)記，如SNP（single nucleotide polymorphi

11、sm）。,RAPD由Williams 等（1990）和Welsh等（1990）分別發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)。這一技術(shù)是以基因組DNA為模板，采用隨機(jī)設(shè)計(jì)的單個(gè)寡核甘酸序列（一般為10bp）為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，用于檢測(cè)DNA序列的多態(tài)性。,RAPD （Random amplified polymorphic DNA）,重復(fù)序列 串聯(lián)重復(fù)序列（tandem repeated sequence），其重復(fù)單位首尾相連，成串排列（Flavell 1986）。 散布重復(fù)序列（interspersed repeated sequence），其重復(fù)單位與其它無(wú)關(guān)序列或單拷貝序列相間排

12、列。,SSR （simple sequence repeats） 或微衛(wèi)星（microsatellite ),微衛(wèi)星DNA序列或SSR又稱短串聯(lián)重復(fù)序列（short sequence repeat，STR），它是由幾個(gè)核甘酸（一般16個(gè)）為重復(fù)單位簇集而成的串聯(lián)重復(fù)序列，可隨機(jī)的分布在整個(gè)基因組的不同位置上。微衛(wèi)星長(zhǎng)度具有高度變異性，并且這種多態(tài)性常常表現(xiàn)復(fù)等位性，兩端的序列多是相對(duì)保守的單拷貝序列，因而可以根據(jù)兩端的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，擴(kuò)增每個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星序列，從而揭示其長(zhǎng)度的多態(tài)性（simple sequence length polymorphism，SSLP）。,SSR,ISSR是一

13、種新型的分子標(biāo)記。與SSR相反，直接用同位素標(biāo)記SSR序列，擴(kuò)增2個(gè)SSR間的單拷貝序列。為了增加擴(kuò)增的特異性，在引物的5和3端分別加入12個(gè)選擇性堿基，引物長(zhǎng)度1618bp。,ISSR（inter-ssr）, AFLP結(jié)合了RFLP和RAPD技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。AFLP的基本原理是基于PCR的擴(kuò)增基因組DNA限制性片段多態(tài)性。基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭（adapter）連接到DNA片段的末端，通過(guò)選擇在3端分別添加13個(gè)選擇性堿基的不同引物，選擇性地識(shí)別具有特異配對(duì)順序的酶切片段并與之結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)特異擴(kuò)增。,AFLP ( Amplicon fragment length po

14、lymorphism),AFLP反應(yīng)過(guò)程示意圖,遺傳信息由DNA mRNA 蛋白質(zhì)。 一個(gè)典型的真核生物mRNA分子：5- U TR ( 5端轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)) , ORF (開放閱讀框架) ,3- U TR ( 3端轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)) ，polyA,任何一個(gè)基因，cDNA 的5端或3端的有限序列即可特異性地代表生物體某種組織某個(gè)時(shí)期的一個(gè)表達(dá)基因。EST 的數(shù)目可以顯示所代表的基因的拷貝數(shù),EST （expressed sequence tags）,從組織細(xì)胞中提取總mRNA ，構(gòu)建成標(biāo)準(zhǔn)cDNA 文庫(kù)，然后從中挑取大量克隆，利用載體通用引物測(cè)出插入載體的cDNA 片段5端或3端300 - 500

15、堿基的序列。 將測(cè)序所得的EST 與dbEST 等數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析,根據(jù)核酸或蛋白質(zhì)序列的同源性比較，可以鑒定出哪些EST 代表已知基因，哪些EST 代表未知基因。,EST,序列標(biāo)簽位點(diǎn)（sequence tagged site） 是一小段DNA序列。每個(gè)基因組僅1個(gè)拷貝，很容易分辨。STS要滿足2個(gè)條件： 是一段已知的序列，可據(jù)此涉及PCR引物來(lái)檢測(cè)不同DNA片斷中是否存在 這一序列。 STS在染色體上必須是獨(dú)一無(wú)二的。如果在基因組中有多個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)，作圖數(shù)據(jù)將含混不清。 常見的尋找STS的方法： EST、 SSLP、 隨機(jī)基因組序列,STS,單核苷酸多態(tài)性是指基因組序列中由于單個(gè)核

16、苷酸(,)的替換而引起的多態(tài)性。通常SNPs不包括堿基的插入、缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。這種標(biāo)記只有兩種等位基因。 人類基因組的編碼基因中有20萬(wàn)個(gè)SNPs, 在非編碼區(qū)的數(shù)目可能還要多10倍以上。 單倍型：當(dāng)前常用術(shù)語(yǔ)“happlotype”(單倍型)代替術(shù)語(yǔ)“allele”(等位基因)。在給定的一條染色體的緊密連鎖的位點(diǎn)上多個(gè)等位基因的集合,通常34個(gè)相鄰等位基因彼此靠近而構(gòu)成的單倍型可作為一個(gè)整體而遺傳(稱為單倍型塊(haploblock),SNP ( single nucleotide polymorphism ),（二） 遺傳圖譜的構(gòu)建,1 人類基因組遺傳圖譜的構(gòu)建 人類的遺傳圖

17、譜是利用家系分析法，在對(duì)8個(gè)家系的134個(gè)成員的分析中(186個(gè)減數(shù)分裂)，主要根據(jù)5264個(gè)STR標(biāo)記繪制而成的。 利用這些家系的資料繪制第1至22號(hào)染色體圖譜。對(duì)于X染色體圖譜，還利用了來(lái)自另外12個(gè)家系，170個(gè)成員(105個(gè)減數(shù)分裂)的資料繪制而成。 最后，將5264個(gè)標(biāo)記定位在2335個(gè)位點(diǎn)（其中有些標(biāo)記相距很近而作為一個(gè)位點(diǎn)）。,2 植物基因組遺傳圖譜的構(gòu)建,作圖群體 常用的遺傳作圖群體有F2群體、回交群體、加倍單倍體（double haploid，DH）群體、重組近交系（recombinant inbred lines，RIL）群體、近等基因系（nearisogenic line

18、s，NIL）群體等（徐云碧，1994）。 遺傳標(biāo)記的染色體定位,標(biāo)記間的連鎖分析 LINKAGE、Mapmaker、JoinMap,二、 物理圖譜繪制,（一 ）限制性作圖 （二）基于克隆的基因組作圖 （三） 原位雜交 （四）序列標(biāo)簽位點(diǎn)（STS）作圖 （五） 人類基因組圖譜,重疊群（contigous DNA clones, contigs） 從1個(gè)感興趣的位置開始，利用第1個(gè)元件的末端部分來(lái)辯別第2個(gè)元件，沿染色體“行走”（walk）。通過(guò)鑒別目標(biāo)位點(diǎn)兩測(cè)的2個(gè)DNA標(biāo)記，從1個(gè)標(biāo)記向另1個(gè)標(biāo)記的行走。 沿染色體鑒別一系列重疊群是大規(guī)模研究的基礎(chǔ)。在特定區(qū)域的染色體行走可以提供分離通過(guò)遺傳圖

19、譜定位在該區(qū)域基因的方法。集中全部染色體的重疊群，可以為以后研究提供有效克隆來(lái)源。 染色體行走考慮的根本是每“步”的大小，較大的步加快積聚相鄰克隆的進(jìn)程。,（二） 基于克隆的基因組作圖,區(qū)域作圖 Regional mapping,區(qū)域作圖 Regional mapping,Minimal tiling path selected for sequencing.,區(qū)域作圖 Regional mapping,（三） 原位雜交,熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization, FISH） 基因組原位雜交（genome in situ hybridization, G

20、ISH ）,（四）序列標(biāo)簽位點(diǎn)（STS）作圖,輻射雜交系 是含有另一種生物染色體片斷的嚙齒類細(xì)胞。帶有人類染色體片段的輻射雜交系 DNA庫(kù) YAC/BAC 克隆作圖 獲得大分子DNA克隆文庫(kù)以后，用PCR的方法檢測(cè)STS，根據(jù)重疊的STS標(biāo)記繪制克隆連鎖圖。,（四）序列標(biāo)簽位點(diǎn)（STS）作圖,當(dāng)兩個(gè)片段含有同一STS順序時(shí)，則這兩個(gè)片段彼此重疊。如果它們彼此鄰接，這兩個(gè)STS總會(huì)同時(shí)出現(xiàn)在相同片段上。如果它們相距甚遠(yuǎn)，有時(shí)會(huì)在同一片段，有時(shí)則在不同片段。 要將一組STS作圖定位，必需收集來(lái)自同一染色體或整個(gè)基因組隨機(jī)斷裂的DNA片段。不同DNA片段之間有各種可能的重疊，可以覆蓋整個(gè)作圖區(qū)段。依

21、次采用單個(gè)STS挑出它們所在的DNA片段，根據(jù)它們彼此的重疊關(guān)系可以逐段繪DNA物理圖。,生物信息學(xué)是現(xiàn)代生物技術(shù)與計(jì)算機(jī)科學(xué)的結(jié)合，收集、加工和分析生物資料和信息的學(xué)科。 應(yīng)用生物信息學(xué)可以將來(lái)自不同的基因組理論和應(yīng)用綜合并標(biāo)準(zhǔn)化，利用大量的生物信息資料了解遺傳網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)、信號(hào)傳遞及相互關(guān)系，計(jì)算機(jī)還可進(jìn)行一些生物模擬研究。 利用生物信息學(xué)能夠分析從微生物、動(dòng)物、植物以及人類基因組序列測(cè)定產(chǎn)生的大量資料，闡明遺傳信息。 研究?jī)?nèi)容兩大類：DNA 數(shù)據(jù)分析； 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)分析。,第三節(jié)生物信息學(xué)(bioinformatics),基因芯片,基因芯片(gene chip),又稱DNA微陣列(microarray),是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列,其基本原理是通過(guò)雜交檢測(cè)信息。利用基因芯片,可以實(shí)現(xiàn)基因信息的大規(guī)模檢測(cè)。,生物信息學(xué)的應(yīng)用,（一）發(fā)現(xiàn)新基因和新的單核苷酸多態(tài)性 在研究生物的基因時(shí),不斷的發(fā)現(xiàn)新的基因。一般說(shuō)