微生物平板劃線試驗(yàn)

1、平板劃線實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí),一、相關(guān)基礎(chǔ)理論細(xì)菌的培養(yǎng),一般細(xì)菌均可用人工方法進(jìn)行培養(yǎng)，使其生長(zhǎng)繁殖，以便進(jìn)一步觀察和研究他們的各種生物學(xué)特征。為了獲得良好的細(xì)菌培養(yǎng)物，在分離培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，除采用適宜的培養(yǎng)基，并考慮到其他的培養(yǎng)條件之外，掌握各種分離培養(yǎng)和接種的基本技術(shù)，也是重要環(huán)節(jié)。,1、培養(yǎng)基,在土壤、水、食品、空氣以及人和動(dòng)、植物中，不同種類的細(xì)菌混雜地生活在一起。若要研究其中某種細(xì)菌，就必須將各種細(xì)菌進(jìn)行分離，以得到只含有這一種細(xì)菌的純培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌分離成純種后，常需要接種到有關(guān)的培養(yǎng)基中，以測(cè)試其各種生物學(xué)性狀，不同的細(xì)菌需要不同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。,1、培養(yǎng)基,培養(yǎng)基按其物理性狀，分為固體培養(yǎng)基、

2、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基按用途，分基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基。,按物理狀態(tài)不同劃分,固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基,在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)，瓊脂含量一般為1.5%-2.0%,瓊脂含量一般為0.2%-0.7%,不加任何凝固劑,半固體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基常用來進(jìn)行微生物的分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)及菌種保藏,觀察微生物的運(yùn)動(dòng)特征、分類鑒定及噬菌體效價(jià)滴定,大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面的研究,按用途不同劃分,基礎(chǔ)培養(yǎng)基,鑒別培養(yǎng)基,用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基,用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基,選擇培養(yǎng)基,

3、在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)制成的一類營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基,微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化,牛膏蛋白胨培養(yǎng)基是最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,加富培養(yǎng)基,2、常見培養(yǎng)基,基礎(chǔ)培養(yǎng)基 肉浸液培養(yǎng)基：一般細(xì)菌都能在此培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng) 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：一般細(xì)菌培養(yǎng)使用 蛋白胨水培養(yǎng)基：靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn),2、常見培養(yǎng)基,加富培養(yǎng)基 血瓊脂培養(yǎng)基：可作為肺炎球菌、鏈球菌、葡萄球 菌、嗜血桿菌等的分離培養(yǎng)，還可用 于某些菌落的溶血作用 巧克力瓊脂培養(yǎng)基：淋球菌及腦膜炎雙球菌在此培養(yǎng) 基上生長(zhǎng)較佳,2、常見培養(yǎng)基,選擇培養(yǎng)基 亞硒酸鹽增菌液：作為沙門氏菌屬及某些志賀氏菌屬

4、 增菌用 伊紅美藍(lán)瓊脂：分離沙門氏及志賀氏菌屬細(xì)菌 Baird-Parker培養(yǎng)基：用于金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)分 離,2、常見培養(yǎng)基,鑒別培養(yǎng)基 三糖鐵瓊脂：供鑒定腸道細(xì)菌用 雙糖含鐵瓊脂：供鑒定腸道細(xì)菌用 葡萄糖枸櫞酸鹽瓊脂：共作鑒別大腸桿菌與產(chǎn)氣桿菌 之用,二、細(xì)菌的接種方法,將混合的細(xì)菌分離的方法有多種，平板劃線法即是其中之一，該方法主要是借劃線而將混雜的細(xì)菌在瓊脂平板表面分散開，是單個(gè)細(xì)菌能固定在某一點(diǎn)，生長(zhǎng)繁殖后形成單個(gè)的菌落以達(dá)到分離純種的目的。 當(dāng)細(xì)菌分離成純種后，一般還可用斜面、液體和半固體培養(yǎng)基來檢驗(yàn)細(xì)菌的培養(yǎng)特征，因此接種方法可相應(yīng)的分為四種。,表3 常見的幾種細(xì)菌的培養(yǎng)和基

5、接種方法舉例,1、斜面培養(yǎng)基接種法,常用于細(xì)菌的大量繁殖，保存菌種，或觀察其某些生化特性。瓊脂斜面、尿素培養(yǎng)基、雙糖鐵培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基等具有斜面外形的固體培養(yǎng)基均可用此法接種。,1、斜面培養(yǎng)基接種法,步驟：（1）用記號(hào)筆在待接種的培養(yǎng)管上寫明標(biāo)記。 （2）點(diǎn)燃酒精燈。 （3）左手拇指、食指、中指及無名指分別握持菌 種與待接種的培養(yǎng)基管，使菌種管位于左側(cè)， 斜面部均應(yīng)向上。 （4）以右手拇指和食指捏持轉(zhuǎn)動(dòng)兩管試管塞，以 便在接種是易于拔取。 （5）右手持接種環(huán)，在火焰上燒灼滅菌。,1、斜面培養(yǎng)基接種法,（6）以右手手掌及小指，小指及無名指分別拔取并 夾持兩管試管塞，將兩管管管口滅菌。 （7

6、）將已滅菌且已冷卻的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，從 斜面上輕輕挑取少量菌苔退出菌種管。再伸進(jìn) 待接種的培養(yǎng)基管，進(jìn)行斜面培養(yǎng)基接種，從 斜面底部輕輕向頂端彎曲劃線，不要觸破培養(yǎng) 基表面。,1、斜面培養(yǎng)基接種法,（8）接種完畢，滅菌兩試管的管口，塞好試管塞，并放至原來的位置上。重新燒灼接種環(huán)，滅菌后放回試管架上。接種好的試管放37溫箱培養(yǎng)，1824小時(shí)候觀察生長(zhǎng)情況。,1、斜面培養(yǎng)基接種法,圖2-1 斜面培養(yǎng)基接種法,2、液體培養(yǎng)基接種方法,可用于觀察細(xì)菌不同的生長(zhǎng)狀況，有的呈均勻混濁，有的呈沉淀生長(zhǎng)，還有的在液體表面形成菌膜；另外還可以供測(cè)定細(xì)菌生化特性用。凡是肉湯、葡萄糖蛋白胨水以及各種單糖發(fā)酵管等

7、液體培養(yǎng)基均用此法接種。,2、液體培養(yǎng)基接種方法,步驟:（1）用記號(hào)筆在待接種培養(yǎng)基上寫明標(biāo)記。 （2）如斜面培養(yǎng)基的接種方法一樣，握持菌種管及 接種的肉湯管。 （3）接種環(huán)滅菌冷卻后，伸入菌種管取少量細(xì)菌再 伸入肉湯管內(nèi)，在接近液面管壁處輕輕研磨， 蘸取少量肉湯調(diào)和，使菌混于肉湯中。塞好試 管塞后，搖動(dòng)液體，使細(xì)菌在液體中均勻分布。 （4）接種完畢，將接種環(huán)滅菌后放回試管架上。肉 湯管放37溫箱培養(yǎng)，1824小時(shí)后觀察生長(zhǎng) 情況。,2、液體培養(yǎng)基接種方法,圖2-2 液體培養(yǎng)基接種法,3、穿刺接種法,常用于半固體瓊脂培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基、雙糖鐵培養(yǎng)基等的接種，前者用于測(cè)定細(xì)菌的動(dòng)力，后二者則用

8、于觀察細(xì)菌的生化反應(yīng)。,3、穿刺接種法,步驟:（1）用記號(hào)筆在待接種培養(yǎng)基上寫明標(biāo)記。 （2）如斜面培養(yǎng)基接種法，握持菌種管及待接種 的半固體瓊脂培養(yǎng)基。 （3）右手持接種針，滅菌冷卻后，以針挑取菌 苔，垂直刺入半固體瓊脂培養(yǎng)基的中心，刺 達(dá)近管底部，但不必及于管底，然后循原路 退出。 （4）接種完畢，接種針重新滅菌后放至試管架 上，塞好試管塞，37培養(yǎng)1824小時(shí)后取 出觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。,3、穿刺接種法,圖2-3 穿刺接種法,4、平板劃線接種法,常用于分離單個(gè)菌落，也可用于觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況和觀察某些生化反應(yīng)。沙門氏菌的各屬在亞硫酸鉍瓊脂平板上呈黑色，具有金屬光澤；志賀氏菌屬在HE瓊脂平

9、板、SS瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板上呈現(xiàn)無色透明不發(fā)酵乳糖的菌落。,4、平板劃線接種法接種方法,（1）標(biāo)記 在培養(yǎng)皿底面，用記號(hào)筆注明接種的菌名、接種 者姓名、日期等。,4、平板劃線接種法,（2）滅菌接種環(huán) 點(diǎn)燃酒精燈，右手以持筆式握持接種環(huán)，并放置火焰中燒灼滅菌，先將接種環(huán)的接種絲部分置于火焰中，待金屬絲燒紅并蔓延至金屬端，再直接燒灼金屬環(huán)直至燒紅，然后由金屬環(huán)至金屬桿方向快速通過火焰，隨后再反方向通過火焰，如此23次。然后將接種環(huán)移開火焰，待其冷卻。,4、平板劃線接種法,圖2-4 滅菌接種環(huán),4、平板劃線接種法,（3）取菌種 左手持裝有金黃色葡萄球菌或大腸桿菌菌液的試管，用持有接種環(huán)的右手手

10、掌及小指拔取試管塞，將試管管口迅速通過火焰23次進(jìn)行滅菌。 將已滅菌且已冷卻的接種環(huán)伸入菌種管中，取一接種環(huán)的菌液，然后退出菌種管，將菌種管管口再次通過火焰23次滅菌，塞好試管塞，放至原來的位置。,4、平板劃線接種法,（4）分離劃線接種細(xì)菌（四區(qū)接種法） 左手持瓊脂平板培養(yǎng)基（將皿蓋反放在桌上酒精燈附近），盡量使之直立以免空氣中的細(xì)菌落入其中，并靠近火焰。右手持接種環(huán)在瓊脂平板上端來回劃線，涂成一細(xì)菌薄膜（約占平板的1/10），視為一區(qū)。劃線時(shí)使接種環(huán)與接種平板面呈3040度角，以腕力在平板表面行輕而快地來回滑動(dòng)動(dòng)作。 旋轉(zhuǎn)瓊脂平板90度，燒灼接種環(huán)，以殺滅環(huán)上的殘留細(xì)菌，將接種環(huán)觸及培養(yǎng)基表

11、面以使其冷卻。滅菌接種環(huán)通過薄膜處作連續(xù)平行劃線（約占平板1/5），此視為二區(qū)。,4、平板劃線接種法,旋轉(zhuǎn)瓊脂平板90度，灼燒接種環(huán)滅菌并使之冷卻。將滅菌接種環(huán)接二區(qū)連續(xù)平行劃線（約占平板1/4），此為三區(qū)。 旋轉(zhuǎn)瓊脂平板90度，接種環(huán)不必再滅菌，接三區(qū)連續(xù)平行劃線，劃滿平板其余部分，此視為四區(qū)。 各區(qū)接種線間盡量互不交接，以達(dá)到細(xì)菌逐漸稀釋的目的。,4、平板劃線接種法,圖2-5 四區(qū)劃線,4、平板劃線接種法,4、平板劃線接種法,（5）劃線完畢，將瓊脂平板放進(jìn)皿蓋，將培養(yǎng)皿倒放，送進(jìn)37溫箱培養(yǎng)。 （6）培養(yǎng)1824h后將培養(yǎng)皿取出。觀察瓊脂平板表面生長(zhǎng)的各種菌落，注意其大小、形狀、邊緣、表面

12、結(jié)構(gòu)、透明度、顏色等性狀。,三、金黃色葡萄球菌和普通大腸桿菌平板劃線接種實(shí)驗(yàn),1、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 2、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?3、實(shí)驗(yàn)用品 4、實(shí)驗(yàn)步驟 5、觀察結(jié)果,1、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,（1）四區(qū)劃線法接種金黃色葡萄球菌至血瓊脂培養(yǎng)基平皿一個(gè) （2）四區(qū)劃線法接種普通大腸桿菌至伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基平皿一個(gè),2、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?（1）熟悉四區(qū)劃線法接種細(xì)菌 （2）培養(yǎng)嚴(yán)格的無菌操作意識(shí),3、實(shí)驗(yàn)用品,（1）菌液：金黃色葡萄球菌和普通大腸桿菌菌液各一管。 （2）實(shí)驗(yàn)器械：酒精燈一個(gè)、血平板一個(gè)、伊紅美藍(lán)平板一個(gè)、接種環(huán)一支。,4、實(shí)驗(yàn)步驟,參照前面介紹的四區(qū)劃線法的操作步驟操作，一定要在無菌條件下，養(yǎng)成無菌意識(shí)。,（1）標(biāo)記 （2）

13、滅菌接種環(huán) （3）取菌種 （4）分離劃線接種細(xì)菌 （5）劃線完畢，送進(jìn)37溫箱培養(yǎng) （6）培養(yǎng)1824h ，觀察結(jié)果,5、觀察結(jié)果,結(jié)果觀察在1824小時(shí)以后 菌落：標(biāo)本或液體培養(yǎng)物劃線接種到固體培養(yǎng)基表面后，單個(gè)細(xì)菌經(jīng)分裂繁殖可形成一個(gè)肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)，稱為菌落。,5、觀察結(jié)果,(1)菌落的形態(tài)特征：大小、形狀（露滴狀、圓形、菜花樣、不規(guī)則等）、突起或扁平、凹陷、邊緣（光滑、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等）、顏色（紅色、灰白色、黑色、綠色、無色、黃色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。,5、觀察結(jié)果,(2)菌落溶血特征：菌落溶血有下列3種情況。溶血：又稱草綠色溶血，菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)12mm的草綠色環(huán)，為高鐵血紅蛋白所致；溶血：又稱完全溶血，菌落周圍形成一個(gè)完全清晰透明的溶血環(huán)，是細(xì)菌產(chǎn)生的溶血素使紅細(xì)胞完全溶解所致；溶血：即不溶血，菌落周圍的培養(yǎng)基沒有變化，紅細(xì)胞沒有溶解或