微生物遺傳變異.ppt

1、第 四 章 微生物遺傳和變異,目的要求： 通過本章的學(xué)習(xí)，使學(xué)生掌握細(xì)菌基因重組，真菌基因重組和微生物誘變育種的基本原理和方法。 要求掌握： 1、細(xì)菌基因重組的原理和方法。 2、真菌基因重組的原理和方法。 3、微生物誘變育種的原理和方法。 4、基因工程的基本原理 5、基因表達(dá)的調(diào)控 重 點(diǎn)： 基因突變及修復(fù)、細(xì)菌的基因重組 難 點(diǎn)： 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)，高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)，準(zhǔn)性生殖，基因表達(dá)的調(diào)控,遺傳：,親代與子代相似,變異：,親代與子代、子代間不同個體不完全相同,遺傳（inheritance）和變異（variation）是生命的最本質(zhì)特性之一,遺傳型： (genotype),表型： (phenotype),生

2、物的全部遺傳因子所攜帶的遺傳信息,具有一定遺傳型的個體，在特定環(huán)境條件下通過生長發(fā)育所表現(xiàn)出來的外表特征和內(nèi)在特征的總和。,表型是由遺傳型所決定，但也和環(huán)境有關(guān)。,遺傳型環(huán)境條件,表型,表型飾變：,表型的差異只與環(huán)境有關(guān)，不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化 特點(diǎn)：暫時性、不可遺傳性、表現(xiàn)為全部個體的行為,遺傳型變異（基因突變）：,遺傳物質(zhì)改變，導(dǎo)致表型改變 特點(diǎn)：遺傳性、群體中極少數(shù)個體的行為（自發(fā)突變頻率通常為10-6-10-9）,Production of a red pigment (prodigiosin) by Serratia marcescens（粘質(zhì)沙雷

3、氏菌）. From left to right: slant culture grown at 25C, slant culture grown at 37C, broth culture grown at 25C, broth culture grown at 37C.,微生物是遺傳學(xué)研究中的明星：,微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，營養(yǎng)體一般為單倍體， 方便建立純系。 很多常見微生物都易于人工培養(yǎng)，快速、大 量生長繁殖。 物種和代謝類型多樣 對環(huán)境因素的作用敏感，易于獲得各類突變株， 操作性強(qiáng)。,第一節(jié) 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),1、經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 肺炎鏈球菌：S型（菌體具莢膜，菌落表面光滑，有 致病能力） R型（

4、菌體無莢膜，菌落表面粗糙，無 致病能力）,一、三個證明核酸是遺傳物質(zhì)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn),1928年，F(xiàn).Griffth的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),1944年，Avery的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，確定了轉(zhuǎn)化因子,實(shí)驗(yàn)證明，將R菌轉(zhuǎn)化為S菌的轉(zhuǎn)化因子是DNA！,2、噬菌體感染實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)證明，進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)是DNA。DNA包含有產(chǎn)生完整噬菌體的全部信息。,32P標(biāo)記DNA,35S標(biāo)記蛋白質(zhì),3、植物病毒TMV重建實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)證明，TMV的遺傳物質(zhì)是RNA。,朊病毒的發(fā)現(xiàn)和思考:,朊病毒,蛋白質(zhì)是遺傳物質(zhì),？,1、細(xì)胞水平 2、細(xì)胞核水平 3、染色體水平 4、核酸水平 5、基因水平 6、密碼子水平 7、核苷酸水平,二、遺傳物質(zhì)在微生

5、物細(xì)胞內(nèi)存在的部位和形式 （一）遺傳物質(zhì)在7個水平上的形式,1、細(xì)胞水平 真核微生物：細(xì)胞核 原核微生物：核區(qū) 細(xì)胞核或核區(qū)的數(shù)目在不同的微生物中是不同的,2、細(xì)胞核水平 真核生物 細(xì)胞核 核染色體 原核生物 核區(qū) DNA鏈,核基因組,在核基因組之外，還存在各種形式的核外遺傳物質(zhì),3、染色體水平 真核生物染色體是由組蛋白與DNA構(gòu)成的線狀結(jié)構(gòu) 真核生物通常為多倍體 原核生物的染色體只有閉合環(huán)狀的DNA鏈 原核生物為單倍體 染色體的數(shù)目在不同的生物中是不同的,4、核酸水平 核酸種類：DNA，RNA 核酸結(jié)構(gòu)：雙鏈、單鏈； 環(huán)狀，線狀，超螺旋狀 DNA長度：因種而異,微生物基因組測序工作是在人類基

6、因組計(jì)劃的促進(jìn)下開 始的，最開始是作為模式生物，后來不斷發(fā)展，已成為 研究微生物學(xué)的最有力的手段。,5、基因水平,它的物質(zhì)基礎(chǔ)是一個具有特定核苷酸順序的DNA片段。,1909年 丹麥生物學(xué)家WJohansen,結(jié)構(gòu)基因：是為細(xì)胞結(jié)構(gòu)、組成(如細(xì)胞生化反應(yīng)所需的酶)及 完成細(xì)胞功能所需的蛋白質(zhì)等進(jìn)行編碼的基因。 調(diào)節(jié)基因：用于編碼調(diào)節(jié)蛋白的基因。 操縱基因：是位于啟動子和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序， 能與調(diào)節(jié)蛋白相結(jié)合，以此來決定結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn) 錄是否能進(jìn)行。 重復(fù)基因：DNA片段重復(fù) 跳躍基因：可在DNA上轉(zhuǎn)移位置的基因（IS因子、Tn因子）,6、密碼子水平,7、核苷酸水平 核苷酸是最小突變單位

7、和交換單位,（二）微生物基因組結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),1、原核生物（細(xì)菌）的基因組,1）染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子（單倍體）； 2）基因組上遺傳信息具有連續(xù)性； 基因數(shù)基本接近由它的基因組大小所估計(jì)的基因數(shù) 一般不含內(nèi)含子，遺傳信息是連續(xù)的而不是中斷的。 3）功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因組成操縱子結(jié)構(gòu)； 4）結(jié)構(gòu)基因的單拷貝及rRNA基因的多拷貝； 5）基因組的重復(fù)序列少而短；,2、真核微生物（啤酒酵母）的基因組,1）典型的真核染色體結(jié)構(gòu)； 啤酒酵母基因組大小為13.5106bp，分布在16條染色體中。 2）沒有明顯的操縱子結(jié)構(gòu)； 3）有間隔區(qū)（即非編碼區(qū)）或內(nèi)含子序列； 4）重復(fù)序列多；,第一個完成基因組測序的

8、真核生物基因組,2、古生菌（詹氏甲烷球菌）的基因組,第一個完成基因組測序的古生菌,只有40的基因與其他兩界的生物有同源性 古生菌的基因組在結(jié)構(gòu)上類似于細(xì)菌 1.66x106bp的環(huán)狀染色體DNA 1682個ORF(Open Reading Frame) 3) 負(fù)責(zé)信息傳遞功能的基因（復(fù)制 、轉(zhuǎn)錄和翻譯）則類似于真核生物,（三）轉(zhuǎn)座因子,轉(zhuǎn)座因子：細(xì)胞中能改變自身位置（例如從染色體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到另一個位點(diǎn)，或者在兩個復(fù)制子之間轉(zhuǎn)移）的一段DNA序列。,插入序列（insertion sequence, IS),轉(zhuǎn)座子（transposon, Tn),某些病毒（Mu噬菌體）,原核生物的轉(zhuǎn)座因子：,轉(zhuǎn)座

9、的遺傳學(xué)效應(yīng)：,1）插入突變,2）產(chǎn)生染色體畸變,3）基因的移動和重排,質(zhì)粒通常不含有細(xì)胞初級代謝的遺傳信息，而含有關(guān)于次級代謝的遺傳信息,質(zhì)粒是獨(dú)立存在于細(xì)菌染色體外或附加在染色體上的遺傳物質(zhì)。它由一共價閉合環(huán)DNA分子組成。,（四）染色體外的遺傳因子質(zhì)粒（Plasmid）,1、致育因子(fertility factor, F因子) 又稱F質(zhì)粒，一種與大腸桿菌的有性生殖現(xiàn)象（接合作用）有關(guān)的質(zhì)粒。 攜帶F質(zhì)粒的菌株稱為F+菌株（相當(dāng)于雄性）， 無F質(zhì)粒的菌株稱為F-菌株(相當(dāng)于雌性)。 F質(zhì)粒整合到宿主細(xì)胞染色體上的菌株稱為高頻重組菌株（high frequence recombinatio

10、n, 簡稱Hfr) 由于F因子能以游離狀態(tài)(F+)和以與染色體相結(jié)合的狀態(tài)(Hfr)存在于細(xì)胞中，所以又稱之為附加體(episome)。,質(zhì)粒的類型:,2、抗性因子(resistancefactor，R因子) 另一類普遍而重要的質(zhì)粒，主要包括抗藥性和抗重金屬二大類，簡稱R質(zhì)粒。帶有抗藥性因子的細(xì)菌有時對于幾種抗生素或其它藥物呈現(xiàn)抗性。 例如R1質(zhì)粒(94kb)可使宿主對下列五種藥物具有抗性： 氯霉素(Cm)、鏈霉素(Sm)、磺胺(Su)、 氨芐青霉素(Ap)、卡那霉素(Km)。 并且負(fù)責(zé)這些抗性的基因是成簇地存在于R1抗性質(zhì)粒上。 許多R質(zhì)粒能使宿主細(xì)胞對許多金屬離子呈現(xiàn)抗性，包括碲(Te6+

11、)、砷(As3+)、汞(Hg2+)、鎳(Ni2+)、鈷(Co2+)、銀(Ag+)、鎘(Cd2+)等。在腸道細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的R質(zhì)粒，約有25是抗汞離子的，而銅綠假單胞菌中約占75。,3、細(xì)菌素質(zhì)粒 Col質(zhì)粒含有編碼大腸菌素的基因 4、毒性質(zhì)粒 具有編碼毒素的基因 5、降解質(zhì)粒 攜帶有能降解某些物質(zhì)的酶的基因 6、共生質(zhì)粒 攜帶有與固氮有關(guān)的基因 7、代謝型質(zhì)粒 控制某一特殊代謝過程 8、隱蔽質(zhì)粒 此類質(zhì)粒不顯示任何表型效應(yīng)，只有通過物理的方法檢測其存在,松弛型質(zhì)粒（relaxed plasmid)：質(zhì)粒在宿主中可以有10100個拷貝，也稱為高拷貝數(shù)質(zhì)粒。,嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒(stringent plasm

12、id)：質(zhì)粒在每個宿主細(xì)胞中只有14個拷貝，也叫低拷貝數(shù)質(zhì)粒。,窄宿主范圍質(zhì)粒：質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)較特異，只能在一種特定的宿主細(xì)胞中復(fù)制。,廣宿主范圍質(zhì)粒：質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)不太特異，可以在許多種細(xì)菌中復(fù)制。,質(zhì)粒的特點(diǎn)：,1、不親和性 可以共存于同一細(xì)胞中的不同質(zhì)粒彼此是親和的，而不能共存于同一細(xì)胞的質(zhì)粒彼此不親和，質(zhì)粒的這種特性稱為不親和性。 2、可消除性 3、能自我復(fù)制，穩(wěn)定的遺傳； 4、沒有質(zhì)粒的細(xì)菌不能自發(fā)的產(chǎn)生質(zhì)粒,但可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合作用的轉(zhuǎn)移獲得質(zhì)粒； 5、質(zhì)?？梢詳y帶供體細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)移。,質(zhì)粒的功能：,2、可作為基因轉(zhuǎn)移的載體。,1、質(zhì)?？刂萍?xì)菌的某一遺傳性狀；,第二節(jié) 基因

13、突變和誘變育種,基因突變：一個基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何可 遺傳的改變。,基因突變,狹義：點(diǎn)突變（一對或少數(shù)幾對堿基的缺失、插入或置換）,野生型（原始性狀）,基因突變,突變型（新性狀）,廣義：基因突變和染色體畸變（大片段染色體的缺失、重 復(fù)、倒位）,一、基因突變的定義,自發(fā)突變：在自然條件下發(fā)生的基因突變。,誘發(fā)突變：利用物理化學(xué)因子處理微生物使其產(chǎn)生的突變。,回復(fù)突變：突變菌株發(fā)生突變，回復(fù)到出發(fā)菌株的狀態(tài)。,基因突變分為,二、基因突變的類型,同義突變：堿基的變化沒有改變產(chǎn)物氨基酸序列的變化。,錯義突變：堿基序列的變化引起產(chǎn)物氨基酸的變化。,無義突變：堿基的改變使得密碼子變?yōu)榻K止密碼

14、子。,移碼突變：堿基的缺失或插入使翻譯的閱讀框發(fā)生改變， 從而使氨基酸序列完全變化。,不同的堿基變化對遺傳信息的改變不同：,U,常見的微生物突變體類型：,1、營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）,特點(diǎn)：,在選擇培養(yǎng)基（一般為基本培養(yǎng)基）上不生長,負(fù)選擇標(biāo)記,（突變株不能通過選擇平板直接獲得）,缺乏合成其生存所必需的營養(yǎng)物的突變型。,影印平板（Replica plating）法是Lederberg夫婦在1952年建立,2、抗藥性突變型（resistant mutant),由于基因突變使菌株對某種或某幾種藥物，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性的突變型。,3、條件致死突變型(conditional lethal

15、mutant),在某一條件下具有致死效應(yīng)，而在另一條件下沒有致死效應(yīng)的突變型。,4、形態(tài)突變型(morphological mutant),指造成形態(tài)改變的突變型。,5、其他突變型,1）自發(fā)性 2）不對應(yīng)性 3）稀有性 4）規(guī)律性,三、基因突變的機(jī)制,5）獨(dú)立性 6）可誘變性 7）遺傳性 8）可逆性,1、基因突變的特點(diǎn)：,基因突變自發(fā)性和不對應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)證明：,三個經(jīng)典實(shí)驗(yàn) 變量實(shí)驗(yàn) 涂布實(shí)驗(yàn) 影印實(shí)驗(yàn),證明突變是自發(fā)產(chǎn)生的，并且突變的性狀與引起突變的原因間無直接對應(yīng)關(guān)系。,野生型 （原始性狀）,特定環(huán)境,突變型 （適應(yīng)環(huán)境的新性狀）,馴化,定向誘變,篩選,？,？,？,突變的原因,？,變量實(shí)驗(yàn)（

16、fluctuation analysis） Salvador Luria and Max Delbruck（1943）,Salvador Luria,Max Delbruck,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,變量實(shí)驗(yàn)（fluctuation analysis）,Newcombe的涂布實(shí)驗(yàn)（1949）,影印實(shí)驗(yàn)（replica plating ） Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）,Joshua Lederberg,J. Lederberg is awarded the Noble

17、Prize in Medicine and Physiology in 1958,影印培養(yǎng),無藥物 培養(yǎng)基,含藥物 培養(yǎng)基,影印培養(yǎng)試驗(yàn),原始敏 感菌種,2、自發(fā)突變的機(jī)制,主要的原因是：堿基互變異構(gòu)體的存在導(dǎo)致形成不同 的堿基配對。,腺嘌呤氨基式 AT配對,腺嘌呤亞氨基式 AC配對,堿基置換：堿基與堿基之間的交換導(dǎo)致突變的發(fā)生 轉(zhuǎn)換：嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的堿基置換。 顛換：嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的堿基置換。,3、誘發(fā)突變的機(jī)制 （1）堿基的置換（轉(zhuǎn)換、顛換）,（2）移碼突變：添加或缺失核苷酸，引起閱讀錯誤,（3）染色體畸變：缺失、重復(fù)、插入、易位、倒位,A、堿基類似物,5溴尿嘧啶 （胸腺嘧

18、啶結(jié)構(gòu)類似物）,4、誘變劑,B、嵌入誘變劑,C、與DNA堿基直接其化學(xué)反應(yīng)的誘變劑,D、輻射和熱,嘧啶,嘧啶二聚體,UV,四、DNA損傷的修復(fù),1、光復(fù)活作用 (photoreactivation),嘧啶二聚體,嘧 啶,光解酶,2、切除修復(fù)(excision repair),3、重組修復(fù)（復(fù)制后修復(fù) post replication repair）,4、SOS修復(fù),DNA分子受到較大范圍的重大損傷時誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種應(yīng)急反應(yīng)。,錯誤傾向的SOS修復(fù),五、微生物誘變育種,誘變育種：指利用各種誘變劑處理微生物細(xì)胞，提高基因的隨機(jī)突變頻率，通過一定的篩選方法獲得所需要的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株。,（1）使用簡便有效

19、的誘變劑,（2）選用優(yōu)良的出發(fā)菌株 （3）處理單細(xì)胞或單孢子懸浮液,誘變劑,物理因素：紫外線、激光、離子束、X射線、射線等,化學(xué)因素：烷化劑、堿基類似物、吖啶化合物,（4）使用最佳的處理劑量,致死劑量：將微生物全部殺死的劑量 亞致死劑量：將M大部分殺死，只留下很少的活菌體，如殺死99%以上，存活不到1%，或者殺死90%以上，存活在10%以下。 弱致死劑量：殺死一大半，存活一小半，如殺死50-70%，存活30%-50%，誘變處理一般選用亞致死劑量。,處理劑量：是指處理因素對微生物的生物學(xué)效應(yīng) 劑量 = 強(qiáng)度（濃度） 作用時間 相對劑量 = 殺菌率,（5）設(shè)計(jì)高效率篩選方案,誘變,檢出營養(yǎng)缺陷型,

20、淘汰野生型,鑒定營養(yǎng)缺陷型,富集培養(yǎng) （抗生素法） （菌絲過濾法）,影印平板法,生長譜法,突變株的篩選：產(chǎn)量突變株的篩選 抗藥性突變株的篩選 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選(P152),第三節(jié) 基因重組和雜交育種,一、原核生物的基因重組,基因重組：指兩種不同來源的遺傳物質(zhì)通過交換和重新組合、形成新的基因型的的過程。通過基因重組所獲得的后代具有特異的不同于親本的新基因組合。,供體菌,受體菌,DNA片段,1928年，Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae） 的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象,目前已知有二十多個種的細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力。,轉(zhuǎn)化：指同源或異源的游離DNA分子（質(zhì)粒和染色體

21、DNA）被自然或人工感受態(tài)細(xì)胞提取，并得到表達(dá)的水平方向的基因轉(zhuǎn)移過程。這些被轉(zhuǎn)化的游離的DNA片段稱為轉(zhuǎn)化因子 。轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱為轉(zhuǎn)化子（transformant）。,（一）轉(zhuǎn)化（transformation),感受態(tài)細(xì)胞：受體菌最容易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的 生理狀態(tài)稱為感受態(tài)。,進(jìn)行轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的條件：,1、建立了感受態(tài)的受體細(xì)胞,2、外源游離DNA分子（轉(zhuǎn)化因子）,自然感受態(tài)的出現(xiàn)是細(xì)胞一定生長階段的生理特性，受細(xì)菌 自身的基因控制； 人工感受態(tài)則是通過人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有攝取DNA 的能力，或人為地將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),轉(zhuǎn)化因子通常是雙鏈DNA。,轉(zhuǎn)化過程:,感

22、受態(tài)的出現(xiàn) 轉(zhuǎn)化因子的吸附與摻入 轉(zhuǎn)化因子的整合,感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲和表達(dá)噬菌體DNA分子的生命過程,轉(zhuǎn)染(transfection)：,轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)：提純的噬菌體DNA以轉(zhuǎn)化的（而非感染）途徑進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)后產(chǎn)生完整的病毒顆粒。,人工轉(zhuǎn)化：,用CaCl2處理細(xì)胞，電穿孔等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段。,在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項(xiàng)細(xì)菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。,不是由細(xì)菌自身的基因所控制；,用多種不同的技術(shù)處理受體細(xì)胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。,電穿孔法（electroporation):用高壓脈沖電流擊破細(xì)胞膜形成小孔，使各種大分子（包括D

23、NA)能通過這些小孔進(jìn)入細(xì)胞，所以又稱電轉(zhuǎn)化。,（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）,轉(zhuǎn)導(dǎo)：由噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行遺傳交換的一種方式 一個細(xì)胞的DNA或RNA通過病毒載體的感染轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞中。,細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的類型：,普遍轉(zhuǎn)導(dǎo),局限轉(zhuǎn)導(dǎo),完全轉(zhuǎn)導(dǎo) 流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo),低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo),轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體：能將細(xì)菌宿主的部分染色體和質(zhì)粒DNA帶到另一個細(xì)菌的噬菌體。獲得了由噬菌體攜帶來的供體菌DNA片段的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。在轉(zhuǎn)導(dǎo)中被轉(zhuǎn)移的染色體片段稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。,普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalized transduction）,噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)供體菌染色體的任何部分到受體細(xì)胞中,普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的三種后果：,外源D

24、NA被降解，轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗。,進(jìn)入受體的外源DNA通過與細(xì)胞染色體的重組交換 而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子,流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo),完全轉(zhuǎn)導(dǎo)：,轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進(jìn)行整合、重組和復(fù)制，但其攜帶的基因可經(jīng)過轉(zhuǎn)錄而得到表達(dá)。因此群體中僅一個細(xì)胞含有DNA，而其它細(xì)胞只能得到其基因產(chǎn)物。,流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)：,局限轉(zhuǎn)導(dǎo)：,溫和噬菌體感染,整合到細(xì)菌染色體的特定位點(diǎn)上 宿主細(xì)胞發(fā)生溶源化,溶源菌因誘導(dǎo)而發(fā)生裂解時， 在前噬菌體二側(cè)的少數(shù)宿主 基因因偶爾發(fā)生的不正常切 割而連在噬菌體DNA上,缺陷噬菌體,把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中,缺陷噬菌體DNA分子在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠象正常的DNA分子一樣進(jìn)行復(fù)制、包裝，提供所需要的裂解功能，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)顆

25、粒，感染受體細(xì)胞后，通過DNA整合進(jìn)宿主染色體而形成穩(wěn)定的局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子。,低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：,低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 裂解物,極少量的部分 缺陷噬菌體 （局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體）,轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒,局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子 （極少量）,低感染復(fù)數(shù),高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：,低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 裂解物,正常噬菌體,極少量的 部分缺陷噬菌體 （局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體）,轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒,高感染復(fù)數(shù),雙重溶源菌,缺陷噬菌體和正常噬菌體同步復(fù)制,高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 裂解物,部分缺陷噬菌 （局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體）,正常噬菌體,等量,轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒,局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子 （大量）,局限轉(zhuǎn)導(dǎo)與普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要區(qū)別：,a）局限轉(zhuǎn)導(dǎo)中被轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因與噬菌體DNA連接，與噬菌體DNA一起進(jìn)行復(fù)制、包裝以及被導(dǎo)入受體細(xì)胞中。而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝的

26、可能全部是宿主菌的基因。,b）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒攜帶特定的染色體片段并將固定的個別基因?qū)胧荏w，故稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶的宿主基因具有隨機(jī)性。,（三）接合(conjugation),接合：通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程。結(jié)合后的受體菌稱為接合子（conjugant）。,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm 細(xì)菌的多重營養(yǎng)缺陷型雜交實(shí)驗(yàn),中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致。,證實(shí)接合過程需要細(xì)胞間的直接接觸的“U”型管實(shí)驗(yàn)（ Bernard Davis，1950 ）,接合機(jī)制(大腸桿菌的接合機(jī)制

27、),接合作用是由一種被稱為F因子的質(zhì)粒介導(dǎo)。F因子的分子量通常為5107，上面有編碼細(xì)菌產(chǎn)生性菌毛及控制接合過程進(jìn)行的40多個基因。,F因子為附加體質(zhì)粒 既可以脫離染色體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在，也可插入（整合）到染色體上,F因子的四種細(xì)胞形式：,a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收F因子而變成F+菌株； b）F+菌株(“雄性”菌株)， F因子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面有性菌毛。 c）Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細(xì)胞表面有性菌毛。 d）F菌株，Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F因 子。 細(xì)胞表面

28、同樣有性菌毛。,“接合” “轉(zhuǎn)化” 及“轉(zhuǎn)導(dǎo)”這三種在自然界中存在的細(xì)菌遺傳重組過程各自的特點(diǎn)：,外源DNA的來源及進(jìn)入途徑有差異,（四）原生質(zhì)體融合,原生質(zhì)體融合：將遺傳性狀不同的兩種菌（包括種間、種內(nèi)、及屬間）融合成為一個新的重組子的技術(shù)。,原生質(zhì)體融合步驟：,1、原生質(zhì)體制備 2、原生質(zhì)體融合和再生 3、融合子的選擇,+,+,二、真核微生物的基因重組,能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以進(jìn)行有性雜交,雜交是在細(xì)胞水平上發(fā)生的一種遺傳重組方式。 有性雜交：指性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的一種方式。,（一）有性雜交,（二）準(zhǔn)性雜交,準(zhǔn)性生殖是指真菌中不通過有性

29、生殖的基因重組過程。它可使同一生物的兩個不同來源的體細(xì)胞經(jīng)融合后，不通過減數(shù)分裂而導(dǎo)致低頻率的基因重組。在半知菌類中最為常見。,2、核配和雜合體細(xì)胞二倍體的形成,1、菌絲聯(lián)合形成異核體,準(zhǔn)性生殖的過程：,雜合二倍體只有相對的穩(wěn)定性，在其繁殖過程中雖不進(jìn)行減數(shù)分裂，但在有絲分裂中可以發(fā)生染色體交換和染色體單倍化，從而形成各種分離子。,3、體細(xì)胞交換和單倍體化,體細(xì)胞交換：有絲分裂過程中局部染色體片段交換的現(xiàn)象。 單倍體化：指整條染色體在有絲分裂過程中由于染色體不分離而丟 失的現(xiàn)象。,第四節(jié) 微生物基因表達(dá)的調(diào)控,一、操縱子（operon)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,操縱子：一個或多個結(jié)構(gòu)基因聯(lián)接在一起，形成一個

30、在結(jié)構(gòu)和功 能上協(xié)同作用的整體，受同一個調(diào)節(jié)基因、操縱基因 (operator)和啟動區(qū)（promoter)的調(diào)控。,1、負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控（negative transcription control),調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白（repressor），阻遏蛋白可以與操縱區(qū)結(jié)合，起著阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的作用。,2、正轉(zhuǎn)錄調(diào)控（positive transcription control),調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白（activator ），激活蛋白與相應(yīng)的激活結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，激活結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。,1）負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng),a、沒有誘導(dǎo)物存在時，阻遏蛋白與操縱區(qū)結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄 b、有誘導(dǎo)物存在時，阻遏蛋白與誘導(dǎo)物結(jié)合

31、而不再和操縱區(qū)結(jié) 合，轉(zhuǎn)錄正常進(jìn)行。,典型：大腸桿菌的乳糖操縱子,2）負(fù)控阻遏系統(tǒng),a、沒有輔阻遏物存在時，阻遏蛋白不與操縱區(qū)結(jié)合，轉(zhuǎn)錄進(jìn)行 b、有輔阻遏物存在時，與輔阻遏物結(jié)合的阻遏蛋白可以與操縱 區(qū)結(jié)合，轉(zhuǎn)錄被阻止。,典型：大腸桿菌的色氨酸操縱子,3）正控誘導(dǎo)系統(tǒng),激活蛋白與誘導(dǎo)物結(jié)合后被活化，與激活結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而促進(jìn)RNA聚合酶與啟動子結(jié)合。,(b),典型：麥芽糖正控誘導(dǎo)系統(tǒng),二、信號傳導(dǎo)和雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng),細(xì)胞通過傳感器檢測到信號，然后將信號以變化的形式傳到調(diào)節(jié)部位，這一過程稱為信號傳導(dǎo)（signal transduction）。,原核生物的信號傳導(dǎo)機(jī)制: 雙組分系統(tǒng)（two-com

32、ponent systems)。,傳感蛋白（sensor protein）or 傳感激酶(sensor kinase),應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（response regulator protein),1、傳感激酶位于細(xì)胞膜中，接收 信號后，本身磷酸化。 2、 傳感激酶將磷?；鶄鬟f給反應(yīng) 調(diào)控蛋白，從而使之活化。 3、 被活化的反應(yīng)調(diào)控蛋白調(diào)節(jié)相 應(yīng)的基因的表達(dá)。 4、 磷酯酶將磷?；鶑姆磻?yīng)調(diào)控蛋 白上移去，使之失活。,1,2,3,4,第五節(jié) 微生物與基因工程,一、基因工程,基因工程：在基因水平上，改造遺傳物質(zhì)，即將分離到的或合成的基因經(jīng)過改造，插入載體中，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使其擴(kuò)增和表達(dá)，從而獲得大量基因產(chǎn)物，或者令生物表現(xiàn)出新的性狀。,克隆載體