MTT法測定藥物對細胞生長的抑制作用

1、實驗報告生命科學中的細胞模型姓 名： 龍珍 學 號： 院 系： 藥 學 院 專 業(yè)： 藥 理 學 提交日期： 2012年3月31日 實驗一法測定藥物對細胞生長的抑制作用實驗原理：比色法原理是活細胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶能將淡黃色的還原為藍紫色的結晶甲臜。后者結晶產(chǎn)物的量與活細胞數(shù)目成正相關，而死細胞或紅細胞沒有此功能。結晶用、無水乙醇、酸化異丙醇等溶解，在酶標儀上以波長為490進行比色,所檢測的吸光值的大小可反應細胞代謝活性的強弱。實驗步驟：貼壁細胞消化和吹打(加1ml0.5%胰蛋白酶并輕搖使其遍布所有細胞表面至鏡下觀察發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、間隙增大停止,倒掉,加入含小牛血清的培養(yǎng)液,反復吹打至瓶壁上無貼壁

2、細胞為止。)計數(shù)與分板(取20ul細胞懸液于計數(shù)板計數(shù),用1640培養(yǎng)液調(diào)整使其細胞數(shù)約為1105個/ml,在96孔培養(yǎng)板中加入細胞懸液每孔100ul,共18個,培養(yǎng)箱孵育12h。) 加藥與孵育(于培養(yǎng)板中分別加入濃度為0.1,0.2,0.4,0.8,1.6mg/ml環(huán)磷酰胺注射液各100ul,每組重復3孔,設空白對照組3孔各100ul,孵育23小時。)MTT顯色(每孔加MTT20ul，3小時候棄上清，每孔加DMSO100ul。)酶標儀測定(490nm處測其吸光度實驗結果及討論:1.不同濃度藥物的生長抑制率如下濃度（ug/ml）吸光度（xs）抑制率（%）存活率（%）00.0.01000.10.

3、0.0086635.333764.66630.20.0.14.974885.02520.40.3760.36.735863.26420.80.0.55.973144.02691.60.0.65.058934.94112. 細胞存活率-藥物劑量對數(shù)圖IC50=679.218ug/ml3. 討論： 加藥之前細胞貼壁效果不是很好，分布不太均勻，個別孔細胞有點聚集，加MTT之前藥物抑制作用明顯，尤其體現(xiàn)在是濃度為1.6 mg/ml組。濃度為0.5 mg/ml 抑制相對明顯，其他孔在形態(tài)上看不到太明顯現(xiàn)象。 加DMSO之后顏色對比明顯，并且梯度效果比較好，平行孔間顏色較均勻，而且濃度為0.4ug/ml的

4、顏色和其它孔之間也有區(qū)別，能夠體現(xiàn)出抑制作用。最后通過酶標儀測得的OD值和上述觀察到的現(xiàn)象較吻合。 .前面已經(jīng)說到細胞的貼壁效果不是很好，所以不能夠完全判定藥物的抑制作用，因為如果孔內(nèi)的細胞狀態(tài)不好也有可能導致細胞死亡。 實驗二HE染色法觀察藥物作用細胞后的形態(tài)學變化實驗原理：HE染色法采用兩種染料即堿性染料蘇木素和酸性染料伊紅分別與細胞核和細胞質(zhì)發(fā)生作用，使細胞微細結構通過顏色而改變它的折射率,從而在光鏡下能清晰顯示出細胞圖像,染色的結果是酸性的細胞核被堿性的蘇木素染成藍色，堿性的細胞質(zhì)被酸性的伊紅染成紅色。實驗步驟：1. 樣品制備:胰酶消化貼壁生長細胞,調(diào)整細胞濃度為1105個/ml,每孔

5、2ml加于6孔板,加蓋玻片,加入藥物培養(yǎng)相應時間,取出蓋玻片,用PBS洗滌3次。2. 樣品固定: 95%乙醇固定20min后PBS清洗2次。3. 染細胞核: 蘇木精染色5-10min后自來水水洗。4. 染細胞質(zhì): 伊紅染色1-2min后自來水水洗。5. 脫水、透明: 70%，95%，100%乙醇逐級脫水,二甲苯透明,吹干。6. 封片:中性樹脂封片。實驗結果及分析:這是空白對照，可以看到細胞核 細胞漿的染色比較漂亮，細胞核中的核仁數(shù)目是正常的，細胞核較完整，并且可以看到有個別細胞的細胞核皺縮，說明處于死亡狀態(tài)。這是濃度為0.1mg/ml組，這組的藥物抑制作用不是很明顯，幾乎與空白對照差不多。這組

6、是濃度0.2mg/ml，藥物抑制作用有體現(xiàn)，并有一處細胞核破碎，可看到有部分細胞核皺縮，這組的染色非常的漂亮。濃度為0.4mg/ml組，這組的細胞質(zhì)染色較淺，并且看不清藥物的抑制作用。 濃度為0.8mg/ml，這一組的染色效果很好，但是也看不到藥物的抑制作用，反而可以看到有很多的細胞正處于分化狀態(tài)。（已經(jīng)做標記）藥物濃度1.6mg/ml，這組的細胞核染色較淺，整體上看不到抑制作用，并有個別細胞核進行分裂。綜上所述，藥物對細胞的抑制作用不明顯，并且體現(xiàn)不出濃度趨勢，但是整體的染色效果還算可以。 實驗三吖啶橙熒光染色法觀察細胞形態(tài)學的變化實驗原理：吖啶橙是一種與DNA和RNA都能結合的熒光染料，在

7、藍色光或紫外光的激發(fā)下，DNA和RNA都會激發(fā)出熒光，活細胞經(jīng)過固定，染色后細胞DNA成亮綠色，核仁和散布在細胞質(zhì)中的RNA成橘紅色，胞質(zhì)的其余部分為淡紅褐色。死亡的細胞，因為物質(zhì)就夠發(fā)生變化，其細胞核成暗綠色，細胞質(zhì)也是成暗綠色。實驗步驟： 胰酶消化貼壁細胞,調(diào)整細胞濃度為1105 /ml, 每孔2ml加于6孔板, 加蓋玻片,加入藥物培養(yǎng)相應時間, 取出蓋玻片,用PBS洗滌3次,除去血清95%乙醇固定1530min1%醋酸作用30s110-4AO染色30s60s0.1M CaCl2處理30s2min,PBS漂洗3次PBS封片實驗結果及分析：空白對照組，染色效果較好，可以看到個別細胞正在分裂濃

8、度為0.1mg/ml,藥物作用不明顯，染色很漂亮，濃度為0.2mg/ml,與對照組沒有明顯區(qū)別濃度為0.4，能夠觀察到一點抑制作用，個別細胞的核仁變多，并且有個別細胞的細胞核發(fā)生邊緣化，還有細胞出現(xiàn)空泡化。（已做標記）濃度為0.8mg/ml,藥物作用不明顯，但能看到空泡化，而且有細胞正在進行分化，還有分化剛剛結束，（請看標記） 實驗四TRIzol試劑快速分離細胞和組織中的RNA、蛋白質(zhì)實驗原理：TRIzol試劑是目前最常用的細胞和組織中分離的試劑，其主要成分是苯酚，苯酚的作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白和核酸物質(zhì)釋放，由于極易被分解，所以TRIzol中常加入羥基喹啉，異硫氰酸胍等來抑制內(nèi)源性和外

9、源性活性，以保證完整。TRIzol試劑還利用RNA、蛋白質(zhì)在不同溶液中的溶解性質(zhì),加入氯仿離心后,溶液分為水相、中間層和有機相,取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA,用乙醇沉淀中間層可回收DNA,用異丙醇沉淀可回收蛋白質(zhì),從而實現(xiàn)三者快速分離。實驗步驟：樣品處理: TRIzol處理后的樣品在室溫放置5min,每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,劇烈震蕩15s,室溫放置3min,離心15min.樣品分三層:底層為紅色有機相,上層為無色水相和一個中間層.RNA主要在水相,中間層和有機層用于分離DNA和蛋白質(zhì)。RNA DNA 蛋白質(zhì)取2ul在核算微量檢測儀上測量濃度另取在瓊脂糖凝膠中跑電泳試問

10、晾干后NaOH溶解，再用TE，HEPES調(diào)節(jié)PH雙縮脲試劑檢驗室溫晾干后溶解蛋白質(zhì)75%乙醇洗DNA沉淀后再離心取樣品用核算微量檢測儀測量濃度放置干燥RNA沉淀，用無Rnase水在55-60度下溶解中間和有機相加無水乙醇沉淀后離心異丙醇沉淀蛋白質(zhì)放置10分鐘后離心度離心分乙醇洗滌沉淀，離心異丙醇沉淀水相中的分離蛋白，DNA沉淀用含10%乙醇檸檬酸鈉洗滌，室溫放置5分后離心，棄上清重復一次95%乙醇洗滌沉淀，放置5 分后離心，棄上清，重復兩次，再用用無水乙醇同樣方法洗一次實驗結果及分析：1、RNA電泳圖如下：可以看到28s的亮度不夠，甚至要比18s的亮度低，18s，5s比較正常，2.OD（260

11、nm）/OD（280nm） 濃度DNA 1.14180.3ng/mlRNA 2.011763.9ng/ml3蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑的反應出現(xiàn)陽性結果，但是不是很明顯。4. 本實驗得到的結果雖然都出現(xiàn)陽性結果，但是導致得到的物質(zhì)的收率不是很高有以下幾個原因:a) RNA的得率：樣品勻漿時實際量太少，只是樣品裂解不夠徹底，RNA沉淀沒有完全溶解，還有一些污染等原因?qū)е翿NA降解。b) DNA 蛋白質(zhì)得率：樣品的勻漿和裂解的不徹底，得到的沉淀沒有很好溶解,再就是得到的組織沒有馬上處理導致樣品的降解。 我們只有嚴格的按照試驗的流程操作，從操作步驟，樣品和儀器的準備，以及注意一些操作環(huán)境的維護的事項，這樣才

12、能夠得到欲想要的大分子，進而進行后續(xù)的實驗。實驗五流式細胞儀凋亡分析-雙染色法實驗原理：在凋亡的早期階段，細胞內(nèi)的鈣離子快速持續(xù)上升，使谷氨酰胺轉移酶被激活，造成胞質(zhì)磷脂不對稱喪失，導致膜內(nèi)側磷脂酰絲氨酸從細胞內(nèi)層暴漏與外層，-為的鈣離子依賴性磷脂結合蛋白，并可被熒光物指標記，故被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標記之一，是一種核酸染料，不能透過完整的細胞膜，但在凋亡晚期和壞死的細胞，因為細胞膜受到破壞，而使細胞核染色。實驗步驟： 2ml(濃度為1106 /ml)細胞接種于6孔板/培養(yǎng)皿,培養(yǎng)24h后,加入合適凋亡誘導劑,設置空白對照1孔,加入同濃度藥物各3孔(實驗組)進行細胞干預刺激24h,收集并用PBS洗滌,計數(shù),離心制備單細胞懸液,將細胞懸重于200ul的1binding buffer中,每個樣本濃度約為1106 /ml100ul制備好細胞懸液加入到12mm75mm試管加入5ul-與于制備好細胞懸液中,混勻,室溫孵育5min,加入400ul稀釋后的binding buffer, 1h內(nèi)進行流式細胞儀檢測測定要做3管對照單純細胞樣本細胞樣本只加入5ul-細胞樣本只加入1ul流式細胞儀