221動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù).ppt

1、2.2 動(dòng)物細(xì)胞工程,生產(chǎn)單克隆抗體等,動(dòng)物細(xì)胞工程常用的技術(shù),動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),動(dòng)物細(xì)胞核移植,動(dòng)物細(xì)胞融合,是其他動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。,為什么要進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)?,一.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),如何進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)?,2.2.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù),從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)組織，將它們分散成單個(gè)細(xì)胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長和增殖。,(一)概念,1.進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是什么成分？用胃蛋白酶行嗎？,P44旁欄,提示：用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。胃蛋白酶作用的適宜pH約為2，當(dāng)pH大于6時(shí)，胃蛋白酶就會(huì)失去活性。胰蛋白酶作用的適宜

2、環(huán)境pH為7.28.4。多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的適宜pH為7.27.4，胃蛋白酶在此環(huán)境中沒有活性，而胰蛋白酶在此環(huán)境中活性較高，因此胰蛋白酶適宜用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的消化。,胰蛋白酶真的不會(huì)把細(xì)胞消化掉嗎？為什么？,P44尋根問底,提示：胰蛋白酶除了可以消化細(xì)胞間的蛋白外，長時(shí)間的作用也會(huì)消化細(xì)胞膜蛋白，對(duì)細(xì)胞有損傷作用，因此必須控制好胰蛋白酶的消化時(shí)間。,(二) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程,胚胎或幼齡動(dòng)物的組織器官,細(xì)胞懸液,10代細(xì)胞,50代細(xì)胞,剪碎,胰蛋白酶或膠原蛋白酶,洗滌、稀釋、分離,原代培養(yǎng),用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的PH為7.27.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2

3、.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。,比老齡動(dòng)物的組織細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，有絲分裂旺盛。分化程度越低，繁殖能力越強(qiáng)，越容易培養(yǎng)。,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成生物體,動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。,貼壁生長 接觸抑制,10代以內(nèi)，保持正常二倍體核型,傳代培養(yǎng),原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)、細(xì)胞株和細(xì)胞系,隨細(xì)胞增多，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖,多細(xì)胞動(dòng)物和人體的細(xì)胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，根據(jù)你所學(xué)的內(nèi)環(huán)境的知識(shí)，思考以下問題： 1.體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要提供哪些物質(zhì)？ 2.體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要什么樣的環(huán)境條件？,P46討 論,充足營養(yǎng)（糖

4、、氨基酸、促生長因子、無機(jī)鹽、微量元素等合成成分及血清、血漿等天然成分。）,適宜溫度、PH和氣體環(huán)境；無菌無毒環(huán)境,(三) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件P46,1、無菌、無毒環(huán)境（無菌處理和添加抗生素目的？更換培養(yǎng)液的好處？）,2、營養(yǎng)與體內(nèi)相同。合成培養(yǎng)基：糖、氨基酸、促生長因子、無機(jī)鹽、微量元素等，通常需加入血清、血漿等一些天然成分。,3、溫度和PH，3637、7.27.4）,4、氣體環(huán)境95%空氣、5%CO2-維持培養(yǎng)液PH）,植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較,P47最上面 1、大規(guī)模的生產(chǎn)生物制品。 2、培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞作為基因工程的受體細(xì)胞。 3、檢測(cè)判斷物質(zhì)的毒性。 4、培養(yǎng)正?；蚋鞣N病變的細(xì)

5、胞，用于生理、病理、藥理等方面的研究，如用于 等，為 及其他疾病提供理論依據(jù)。,(四) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用,篩選抗癌藥物,治療和預(yù)防癌癥,二.動(dòng)物細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物,將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞核，移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成為一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體（克隆動(dòng)物）,分 類,細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易,細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)全能性不容易,(一)、 動(dòng)物細(xì)胞核移植概念：,(二)、體細(xì)胞核移植的過程：,請(qǐng)看教材P48圖2-21,思考： 1.核移植的受體細(xì)胞是什么？處在什么時(shí)期？用此細(xì)胞作為受體細(xì)胞有什么好處？ 2.通過什么手段激活受體細(xì)胞，構(gòu)建重組胚胎？,

6、M中期卵母細(xì)胞,誘導(dǎo)方法：物理或化學(xué)方法激活受體細(xì)胞，完成 細(xì)胞分裂和發(fā)育進(jìn)程。,卵母細(xì)胞體積大，便于操作；含有營養(yǎng)物質(zhì)豐富，提供早期胚胎發(fā)育所需的營養(yǎng)；含有激活細(xì)胞核體現(xiàn)全能性的物質(zhì)。,(二)、體細(xì)胞核移植的過程：,P49討論：,1.在體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到受體卵母細(xì)胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細(xì)胞的核？,為使核移植的胚胎或動(dòng)物的遺傳物質(zhì)全部 來自有重要利用價(jià)值的動(dòng)物提供的體細(xì)胞，在 供體細(xì)胞的細(xì)胞核移至受體細(xì)胞之前，必須將 受體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)去掉或?qū)⑵淦茐?P49小資料）。,培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞一般當(dāng)傳代至1050代左 右時(shí)，部分細(xì)胞核型可能會(huì)發(fā)生變化，其細(xì)胞 遺傳物質(zhì)可能會(huì)發(fā)生突變，而10代

7、以內(nèi)的細(xì)胞 一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細(xì) 胞核移植中，為了保證供體細(xì)胞正常的遺傳基 礎(chǔ)，通常采用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞。,2.用于核移植的供體細(xì)胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞，想一想，這是為什么？,3.你認(rèn)為用上述體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動(dòng)物，是對(duì)體細(xì)胞供體動(dòng)物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？,絕大部分DNA來自于供體細(xì)胞核，但其核外還有 少量的DNA，即線粒體中的DNA是來自于受體卵 母細(xì)胞。,此外，即便動(dòng)物的遺傳基礎(chǔ)完全相同，但動(dòng)物的 一些行為、習(xí)性的形成與所處環(huán)境有很大關(guān)系， 核供體動(dòng)物生活的環(huán)境與克隆動(dòng)物所生活的環(huán)境 不會(huì)完全相同，其形成的行為、習(xí)性也不可能和 核供體動(dòng)物

8、完全相同，從這一角度看，克隆動(dòng)物 不會(huì)是核供體動(dòng)物100%的復(fù)制。,(三)、體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景：,1、在畜牧業(yè)中可以加速家畜遺傳改良的進(jìn)程,2、保護(hù)瀕危物種,3、醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)及組織器官的移植,4、了解胚胎發(fā)育和 衰老過程；追蹤研 究疾病的發(fā)展過程 和治療疾病,閱讀課本P50頁,(四)、體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題：,思考與探究,1.幼齡與老齡動(dòng)物的組織細(xì)胞比較，分化程度低的與分化程度高的組織細(xì)胞比較，哪一種更易于培養(yǎng)？思考一下，這是什么道理？,提示：細(xì)胞的衰老與動(dòng)物機(jī)體的衰老有著密切的關(guān)系，細(xì)胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)，幼齡動(dòng)物細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，有絲分裂旺盛，老齡動(dòng)物則相反

9、。所以，一般來說幼年動(dòng)物的組織細(xì)胞比老年動(dòng)物的組織細(xì)胞易于培養(yǎng)。同樣，組織細(xì)胞的分化程度越低，則增殖能力越強(qiáng)，所以更容易培養(yǎng)。,思考與探究,2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)要經(jīng)過脫分化的過程嗎？為什么？,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不需經(jīng)過脫分化過程。因高度分化的動(dòng)物細(xì)胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，所以，動(dòng)物細(xì)胞也就沒有類似植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的脫分化過程了。要想使培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞定向分化，通常采用定向誘導(dǎo)動(dòng)物干細(xì)胞，使其分化成所需要的組織或器官。,3.1997年，美國威斯康星州的一個(gè)奶牛場(chǎng)有一頭 名叫盧辛達(dá)（Lucinda）的奶牛，年產(chǎn)奶量為 30.8 t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀(jì)錄。目 前世界各國高產(chǎn)奶牛

10、場(chǎng)奶牛，年平均產(chǎn)奶量一般 為十幾噸，而我國奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為34 t。 （1）能利用體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)嗎？請(qǐng)說明理由。,可以。盧辛達(dá)的產(chǎn)奶量很高，有高產(chǎn)奶的遺傳基礎(chǔ)，利用盧辛達(dá)的體細(xì)胞克隆的奶牛其遺傳物質(zhì)基本上全部來自該奶牛，其克隆牛具有高產(chǎn)的遺傳基礎(chǔ)，如果精心培育和飼養(yǎng)，有可能在世界范圍內(nèi)推廣，克隆牛再與高產(chǎn)的公牛自然繁殖，可得到很多高產(chǎn)的后代，從而加快奶牛改良進(jìn)程。,該克隆牛不能無限制地推廣，其數(shù)量不宜過多，尤其是在小范圍內(nèi)不能無限的繁殖，以避免奶牛群出現(xiàn)近親繁殖而引起種質(zhì)衰退。,（2）如果將克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)的任務(wù)交給你，你將如何對(duì)它進(jìn)行克??？,從盧辛達(dá)耳朵（也可用

11、別的組織、器官，耳朵在活體上容易?。┥霞羧∫恍K組織，在體外培養(yǎng)獲得該組織（如軟骨組織）的細(xì)胞。從屠宰場(chǎng)取廢棄的牛卵巢，抽取卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟。用顯微針去除卵母細(xì)胞的核，再將耳細(xì)胞注入卵母細(xì)胞，用電刺激方法使卵母細(xì)胞與體細(xì)胞融合，這時(shí)供體核就進(jìn)入了受體卵母細(xì)胞，再用電刺激或化學(xué)物質(zhì)激活注入了體細(xì)胞核的卵母細(xì)胞，使其完成細(xì)胞分裂和發(fā)育過程。核移植胚胎在體外短時(shí)間培養(yǎng)后，挑選正常卵裂的胚胎植入經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母牛體內(nèi)。,4.體細(xì)胞核移植技術(shù)在研究和應(yīng)用上還存在什么問題？請(qǐng)你查閱資料，了解這方面的前沿動(dòng)態(tài)。,研究方面：克隆動(dòng)物基因組重新編程的機(jī)制尚不清楚，克隆技術(shù)效率低，克隆動(dòng)物畸形率高、死亡

12、率高、易出現(xiàn)早衰等問題。這些問題尚在研究中。 應(yīng)用上：生產(chǎn)克隆動(dòng)物費(fèi)用昂貴，距大規(guī)模應(yīng)用還有一定距離。,知識(shí)拓展,1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是如何發(fā)展起來的？,1907年，哈里森（Harrison）在無菌條件下用淋巴液作培養(yǎng)基，培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織存活數(shù)周，并觀察到神經(jīng)細(xì)胞突起的生長過程，由此創(chuàng)建了蓋片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法，奠定了動(dòng)物組織體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)。之后，又有人將懸滴培養(yǎng)法改良為雙蓋片培養(yǎng)，提高了傳代效率并減少了污染。1923年，卡雷爾（Carrel）設(shè)計(jì)了卡氏瓶培養(yǎng)法，擴(kuò)大了組織生存空間。 1951年， 厄爾 （Earle） 發(fā)明了體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的人工合成培養(yǎng)基。1951年，波米拉（Pomer

13、at）設(shè)計(jì)了灌流小室，使細(xì)胞生活在不斷更新的培養(yǎng)液中，便于作顯微攝影和細(xì)胞代謝的研究。1957年，格拉夫（Graff）用灌流技術(shù)進(jìn)一步提高了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的效率。1957年，杜爾貝科（Dulbecco）等人采用胰蛋白酶消化處理和應(yīng)用液體培養(yǎng)基的方法，獲得了單層細(xì)胞培養(yǎng)。單層培養(yǎng)法的出現(xiàn)，對(duì)組織培養(yǎng)的發(fā)展起了很大的推動(dòng)作用。此后單層培養(yǎng)成為組織培養(yǎng)普遍應(yīng)用的技術(shù)。20世紀(jì)60年代后，動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)開始起步，并逐步發(fā)展。20世紀(jì)80年代后，隨著基因工程和其他細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)、生物制藥及其他許多技術(shù)的基礎(chǔ)，在現(xiàn)代生物技術(shù)中發(fā)揮著重要的作用。,知識(shí)拓展,2.為什么

14、動(dòng)物細(xì)胞要分散成單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)？用酶消化的是什么物質(zhì)？,細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)可以分散成單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，也可以用細(xì)胞群（團(tuán)）、組織塊培養(yǎng)，經(jīng)傳代培養(yǎng)后，最終都為細(xì)胞培養(yǎng)。 分散成單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞群（團(tuán)）后容易培養(yǎng)，細(xì)胞所需的營養(yǎng)容易供應(yīng)，其代謝廢物容易排出；而用大塊組織培養(yǎng)時(shí)，內(nèi)部細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)和代謝廢物的排出都較困難，因此，這些細(xì)胞在體外長時(shí)間的生存和生長就較困難。同時(shí)，分散成單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，可使得在細(xì)胞水平操作的其他技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。 用酶消化的是細(xì)胞間基質(zhì)，細(xì)胞間基質(zhì)主要成分有膠原蛋白、層粘連蛋白、纖粘連蛋白、彈性蛋白等成分。用蛋白酶可使其消化，從而使細(xì)胞相互分離。,知識(shí)拓展,3.體細(xì)胞核移植技術(shù)為什么要選擇M期的卵母細(xì)胞做受體細(xì)胞？,細(xì)胞核移植技術(shù)中能用作受體細(xì)胞的通常有M期卵母細(xì)胞和受精卵（合子）。早期核移植技術(shù)中常用受精卵，后來基本上用M期卵母細(xì)胞取代了受精卵，主要因?yàn)閮烧叩募?xì)胞質(zhì)環(huán)境不同。有人認(rèn)為重組需要的因子存在于M期卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中，而在原核形成時(shí)這些因子已被降解或用光，因此，原核擴(kuò)張后受精卵去核可引起胞質(zhì)中重組因子缺乏。成熟促進(jìn)因子（MPF）是卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中重要的胞質(zhì)影響因子，MPF的活性在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的MI期和M期達(dá)到最高，受精