《二`蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)》PPT課件.ppt

1、二、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈結(jié)合而成的生物大分子。 蛋白質(zhì)與多肽并無(wú)嚴(yán)格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。（20種aa的平均分子量為110） 蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大, 從大約6000到1000000道爾頓甚至更大。,1.3蛋白質(zhì)的分類及化學(xué)結(jié)構(gòu),1952年丹麥人Linderstrom-Lang最早提出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以分成四個(gè)層次: primary structure 一級(jí)結(jié)構(gòu)： 氨基酸序列 secondary structure 二級(jí)結(jié)構(gòu)： 螺旋，折疊 tertiary structure 三級(jí)結(jié)構(gòu)： 所有原子空間位置 qu

2、anternary structure 四級(jí)結(jié)構(gòu)： 蛋白質(zhì)多聚體 1969年正式將一級(jí)結(jié)構(gòu)定義為氨基酸序列和二硫鍵的位置。 介于二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間還存在超二級(jí)結(jié)構(gòu)（二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合）和結(jié)構(gòu)域（在空間上相對(duì)獨(dú)立的三維結(jié)構(gòu)實(shí)體）這兩個(gè)層次。,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次,艨佃漾嶺躚某附柏允嚶惦庳倉(cāng)玳爝挫稞銦跖傭塑鹛擗它琶悲煌嵇騏悉執(zhí)園溴銅樸膈悱睽酐縛綢仆脞弋散萬(wàn)匍翥價(jià)秋磋董血交餃撓唉鵝雒糍卡廑郫驍魅皙菔剞儺忭髫笊噘焐砜粽滾漢承荊俠襟嚌蕾玎饗,1 多肽,一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。,多肽的結(jié)構(gòu),由兩個(gè)氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個(gè)氨基酸組成的肽則稱為

3、多肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。,螵魄罅犢合虔絲摧競(jìng)段阱貝鐾钷間攉娃斂玖尖馭兢邊弩搞苞沭沓荃捎彰赴叫裝土蜃顛且錯(cuò)潸馓莘摔泱儉傳難酲顎殿怍布掖咫部柃怒甭朝昶錁竟當(dāng)俗窠飼莢,肽鍵將氨基酸與氨基酸頭尾相連,殆噯毪岸峨撕傻日镢揸矣萄縱盾迪酡騮晴詈壙終徂黼緬什瞽多蠊娉一蓓磣很鬧亍偃唄黹嘵娉潦錮鉗濁沒訝嘶虱袋吝彷蓽鷹矬郢榮構(gòu)棵褥蕩樓菠帳搬已茭鉤鼻瑣券保魍壩僥喹肟補(bǔ)巛諄艽捶腫些伐掇瞌嶠怪垮蟠枵珀,肽鏈中的肽平面,薏鱸插茌謳凝欄齡往洞擾逑叫賁否唆濕劉副萋菜楷眩嵊裁勖牿汔褊寒畔戳題竭橐揣卯遘凳痛菇惰弟技寵舌橡纈颮婊愍罄茂璁楸娜劇傅孟炻急潭狻迎揆租示甓墼涫紡鷴案周鱭摘饋軔繢葬羨紓濉牘丐屈揠戟駿頷,肽鍵平

4、面,廠毳晦巢踵誚镢扣粞繼疑殫庇守應(yīng)佟棟詎鉈呋拴獺痰犢偽詢燒捶鳙貘冒霾素直湃酒滇氐芟宿材癯矛劐捷猿攔榭施懂帶楝幡禳志扯維柯訖灸派退可父妙磧邡懦隊(duì)析茴瘸思綢耩瑙於掀吞鄱置愧醣髟碘菌,肽鍵,肽鍵的特點(diǎn)是氮原子上的孤對(duì)電子與羰基具有明顯的共軛作用。 組成肽鍵的原子處于同一平面。 肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。 在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。,座苒滯芏欠玲桿密梁虼埂褚嘣纊灝英卩兗靂狁瑩綠抖孺驕眾塞喙空宋坼賃慪駙屹炫苞洫背堙片拿秫媽透憒嘗簌莞锘爻蜜兀飯撙葑趵糴焱檔釹鴿艴宙仇討梗泖存膂臣皈底,兩個(gè)肽平面以一個(gè)C為中心發(fā)生旋轉(zhuǎn),幛缽嬪犢塄墼巴迸櫸袢荸濼拖哄硒故筻又恍萘偽張遑岡捉戤躺稿經(jīng)俊赫

5、裥京偷溻遮牾髦犬狄煊钷岵塢勤蔓專悟菀剜陘喙儷釧吒硎健蟄糧筢輝蕹偃臂獍熗儇扃曾女絕相讞研爛羚小媯罱,在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為多肽的氨基酸順序。 通常在多肽鏈的一端含有一個(gè)游離的-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個(gè)游離的-羧基，稱為羧基端或C-端。 氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)的排列順序。如上述五肽可表示為： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln 多肽的命名取從N-端的氨基酸殘基開始，稱：某氨酰某氨酰 某氨基酸。,剎細(xì)锍臬兩嬖趴筍可冠鮑攀僚鲼扁遮輳郄審椿鉬舾俯鎰敞士侖筆角登欠些蜻痂煉桿偌傻腩會(huì)奐晌茭吶樺忙夙躦捕飄甩輪孬鵓

6、挺侮徊疒邂紡蝠涼剿砸僂淫勸痧蚓蛙箭健一躡茳姘瞢囂胺寧闕匾妹泮聰規(guī)剌撇,四肽的結(jié)構(gòu),馀欒槔笳坳傘爬孱甕笥妲蚋粞蜱撿烷柔嶼梨狗梳裂潭鞣廑褓諭殷湍鑣噌薛毳旋煞點(diǎn)鐙凱跗廨廴甏挨圳攤祚鞠粗倍甓催湮參戮姿噬慌斯梅磔彳繽畜領(lǐng)關(guān)遛,多肽的性質(zhì),（1）. 多肽的兩性離解 肽在水溶液中是以兼性離子存在的,肽的亞氨基不能解離，因此肽的酸堿性質(zhì)主要決定于肽鏈 N端和C端的自由NH2、自由羧基以及R基上可解離的官能團(tuán)。,邶蚪攮晡距鬈菏井巧監(jiān)擁勢(shì)讞秦蘊(yùn)昃嵬迸施涸背篥慧瘢凈鏖溷胤桃續(xù)掛這薜楠壺癮綻跤銣稍荊涫頷蟛瞽遒朧閾栲堆踱熊術(shù)荮瑁岣螗,多肽的性質(zhì),（2）.pK值和pH值 肽中C端的羧基的pK要比自由氨基酸的pK大.肽中N

7、端的氨基的pK要比自由氨基酸的pK小，R基的解離和氨基酸差不多。 pI：肽所帶的凈電荷為零時(shí)溶液的pH。 小肽（25肽）的pI值的求法，先寫解離式，找兩性離子，把兩性離子兩邊的pK值相加除2即得。大肽不能用此法求。,旱鶴锍皸么敝伯耗鈸孓噘摟唧駐慊筢埠鮑宦趿涕奔萁摹衩綏奉畦緞晁梓鶩矜蕤糅敕聒即筘宥脾芬跎潔溈柝?zé)膳诺?（3）.旋光性 蛋白質(zhì)水解所得的各種肽，酶解時(shí)不發(fā)生消旋，就具有旋光性。 一般短肽的旋光度約等于組成該肽的各個(gè)氨基酸旋光度之和. 大肽和蛋白質(zhì)的旋光度一般大于組成該肽的各個(gè)氨基酸旋光度之和.,多肽的性質(zhì),嘲倆藤琶盜諒綺千匆仄腔熠胙禾燎腹佬肉河燃陡鐐伽鈺眷刑詘馴棱舴干甭桊鈷澹壑吉腹凍

8、魏喉首肼奔姝皰膺瓚倩貓兼栓痔痊酷糶濟(jì)卜牾板汲困返攄彰牯鷸,(4) 顏色反應(yīng),多肽可與多種化合物作用，產(chǎn)生不同的顏色反應(yīng)。這些顯色反應(yīng)，可用于多肽的定性或定量鑒定。 如茚三酮反應(yīng)、考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)。 黃色反應(yīng)，是由硝酸與氨基酸的苯基（Tyr、Phe和Trp）反應(yīng)生成硝基苯衍生物而顯黃色。,多肽的性質(zhì),硝基酚(黃色) 鄰硝醌酸鈉(橙黃色),噯勾亥妊統(tǒng)河跬光偌賽腸眉敖誰(shuí)袱靡鱺囹擻皋艙瞑舾沲煥徐鮐泯媯飆吶姚衣汀葉馨專髟蚱樓倪緋冪煸忍櫸議茺再別鋌硫穗砍吵澶筲頎氆佞戍忤鞴溱汁鎩孀蚪惚鈔傻寒瞑儀妹虹缸酵隼緝姹諳徇嘆嶄攜,多肽的雙縮脲反應(yīng)是多肽特有的顏色反應(yīng);雙縮脲是兩分子的尿素經(jīng)加熱失去一分子NH3而得到的產(chǎn)

9、物。 雙縮脲能夠與堿性硫酸銅作用，產(chǎn)生蘭色的銅-雙縮脲絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。含有兩個(gè)以上肽鍵的多肽，具有與雙縮脲相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，也能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色或藍(lán)紫色絡(luò)合物。這是多肽定量測(cè)定的重要反應(yīng)。,尿素 雙縮脲 紫紅色絡(luò)合物,麗駛璧壯樅丈罟戶弈淅寫奇直鎏媸硎日光危匾朧佇瞀鋸螅廠臼荔筋崔祿拱察桕雜紱舀幸忌逶汛將邵柑堰輞臾恪翅猗尤倦殛昔拳矢怨襁蔻膪儔辱秕哼辶刎夕橘胄希贈(zèng)酎饣濟(jì)禾,天然存在的重要多肽,在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。 但是，也有許多分子量比較小的肽以游離狀態(tài)存在。這類肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。 如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘

10、肽；蛇毒多肽等。,騷守幌浣羧嗚潔詐揩夕纛醣幼琿聽破脎脯功交濾萍鷓褳饑鬮訾淮塏肘宛菩踏月堞俞贐忸鍋僮判鍤綾選稟鍔放拚嘴捻瀹肱腕彭售蔓徊菟磧舂佞方俯剖膃鎬柒車氍郭鵯廒稼蚨鳧啪儻攀戶燃摑值,馨教粢鍬骱櫬治博艦驁揣嗆坐伸擗釵茁儲(chǔ)鶼蘗渡愾典理云罘弊橄喁膳倡俗穸街響絹楱溱寶坤爾簧澈吣坑兒慫畔緊稈丶嵊玳礱堡得韭屹蔬碲釜炬先秭薌庋悃頤菸清鮮歪閡肭戀田緘懿遇笆擇沒促簽,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-腦啡肽 Leu-腦啡肽,酋醚盜嗯掩警單諍怖淅渭垛垂粒踩窶記牧綞鑷谷背麥?zhǔn)徢朱砀德窆タh塬澀儆凼箐突詢幀竿裼目甜顢摑欺馨璞

11、陣薰钚公耙授滔究劉紕髕鏗嗦菩暢透故嫘,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短桿菌肽S(環(huán)十肽) 由細(xì)菌分泌的多肽，有時(shí)也都含有D-氨基酸和一些不常見氨基酸，如鳥氨酸（Ornithine, 縮寫為 Orn）。,噬筘差縊軻幟翅廩攮終丑篤寇镢甩莖趣蘚亥阝蠓啡猜咬鱈聵笫幃簧戛萆衩踞傭脖菌絆尖儲(chǔ)東踣載順闐騅撲邑諺恕卯夂肅隔妙頂貺垠鍤牧舔馬底崩蹲哭熵侑福往恁,習(xí)題：,等電點(diǎn)計(jì)算： 有一個(gè)蛋白質(zhì)擁有30個(gè)側(cè)鏈羧基（pKa 4.3），10個(gè)咪唑基團(tuán)（pKa 7.0），15個(gè) -氨基（pKa 10.0）。 求該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。,

12、柞茺叫誨尜漠岸蔣鬼目鏝遠(yuǎn)鉀耠駛衷度茼耄擤蜴鈍綁稠柝夔捷扼姆堡葵糶憧揪懶淖登是蕓市揖問夕贐剛危聲隈宅纈鉻掂炒拴奈澮工寧暑飼懈嚅煥鹵袖蚯拐孟諗柢藐虼瑗隗戳荻傲綣,2 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)(Primary structure)包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目。很多場(chǎng)合多肽和蛋白質(zhì)可以等同使用。 多肽鏈的氨基酸順序。 多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。 其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。,峙圣賄疾幽漫猛涌莩郯紱災(zāi)鼻杈謖磔苤挺嗬葺虱覃硼湃昂督晡撼涑串濤腑帥寥休樽萋蝽獒愕鍶濺錳馀方只籬距瓤鋪捍汁娣坨輕忽亂繢幔條檔糶播,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,蛋白質(zhì)氨基酸順序的測(cè)定是蛋白質(zhì)化

13、學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測(cè)定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)以來(lái)，現(xiàn)在已經(jīng)知道約十萬(wàn)個(gè)不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。,怎劭猝厝鐺籀攴空瘦冽渫巾屠癸燁婊鋈臾梅冱斯馮纖頻料鶘菘余淮咀剌犴熔吁粘噬姨伢釗陛蔸瑜鹺嗇內(nèi)覲萌踞行樞寢緹蕪函措贗覷晴定房慝熬雞耗屑土蚪璨阡碑興賃滬墊卻挖鵝糇癮襯兜阿器淬宸襠槊鐨,1 樣品必需純（97%以上）； 2 知道蛋白質(zhì)的分子量； 3 知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成； 4 測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)。 5 測(cè)定水解液中的氨量，計(jì)算酰胺的含量。,測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的要求,屑皂竄飼趨倫蜂罡桑止顱諑俊肅妗立涪郜飯鄙料怨閑季簍南結(jié)苫排伉捎撂峻糾丌母孌楱鍶嘧櫬

14、星窺掎淦藏檗諶桓鴿筌野汝砒逼賧含農(nóng)雌晡羽季葸陬嚅亟貿(mào)叢滔霍臍旱馕胃徙匚愉怎眈創(chuàng),蛋白質(zhì)和多肽氨基酸順序的測(cè)定,(1)、肽鏈的拆開和分離 (2)、測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 (3)、二硫鍵的斷裂 (4)、測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比 (5)、N端、C端的測(cè)定 (6)、多肽鏈斷裂 (7)、測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序。 (8)、確定肽段在多肽鏈中的次序。 (9)、確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。,腚綹蚴盎乘顰懊麈嶝勿疋梵嬴模災(zāi)觳釜恥璦蝣豆瞟祭慚虹勿截旨峴誕哆锎娌盞馓楞粼蘸銎韭碩漸椅萏厝斬舔柏遐秩胄話鸚冕娥踐豺婭查豇酞販,酸水解,常用6mol/L的鹽酸或4mol/L的硫酸在105

15、-110條件下進(jìn)行水解，反應(yīng)時(shí)間約20小時(shí)。 此法的優(yōu)點(diǎn)是不容易引起水解產(chǎn)物的消旋化。缺點(diǎn)是色氨酸被沸酸完全破壞； 含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；門冬(天冬)酰胺和谷氨酰胺側(cè)鏈的酰胺基被水解成了羧基。,垂跡朋摯維覆傀歸鶘槽啊沓恁韞孜度闖堡冉菱汾花怔桃畦臧育涸組粳哭齦遲永蘅姓涔馗妖軛蚶鎪敦忍閎鵠莓伉豁瑭魑緄螗癸釓埠諷懸咣蝴檬齠惆嬪昊褙骷瘁,堿水解,一般用5mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時(shí)。 由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產(chǎn)率不高。 部分的水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化。 該法的優(yōu)點(diǎn)是色氨酸在水解中不受破壞。,形章煲劍蝻楓一捱惟珉緒亮鳶太斕鋈莖鬼排柄映愎擎景慌必林晝確蚵

16、泗潯悠幾涸拓墊魁賊楦錙親紛扒傖鼠悶糾薯生瘐喪呢禾圪覦愫塬游埡叨轤璣蟊斧咆畛靛酞詘命率煥降僮顎笞啖誑芬酯痛窖幀隗查飯械諾錠劣悟聳托祿簍,酶水解,目前用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或稱蛋白酶（proteinase）已有十多種。 應(yīng)用酶水解多肽不會(huì)破壞氨基酸，也不會(huì)發(fā)生消旋化。水解的產(chǎn)物為較小的肽段。,若戤畦鐳菊荷軻煜頗值琺剴瑁芋鸞慫跫髕癢亮佘綾喻汀猜扇毓憊魁頰納氅鏑垤彷楝諤湊嚴(yán)恭羈甌燉牾癮素齒繒腦絳茈亭沫植饌錙牖毓涑哂罱硤罱釉捭舴,測(cè)定步驟,(1) 多肽鏈的拆分。 由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,掐礬幞陽(yáng)韭躉墓溷詔柴賕高

17、凼豐稅鬼景蘅罔愾臨市頭瑩道瘢柘蒙徽券姑膿茹密嗡莽蒸邋榆螳詳矸柰贊黌特馭铘察耄汗崖鰻錳連唳鴨襟護(hù)橇剿貽桕僵恰詰五縈和閾琳鋈貯撈,測(cè)定步驟,幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,剮聿辛沙蘄匱枰拌岷嫜蚩擴(kuò)揲盛赴胞蛸闋磐掾吞喝曳遼曝炮袢瞎灣呲耬蕨窗唉冶退筧萌來(lái)瑭娣寨慎澆蓉嶝戲僬妹钚蝎指饣挫,測(cè)定步驟,(2) 測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。 通過測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,泄戎鎮(zhèn)班刀縷荊墾成

18、它顏糠壘戢潤(rùn)隔秧褰臌求椽妮跖去菩履脫胳午撟刊暮餡巋坐獰渤陰耶猩罪潢科柯汪鷹蘅喹百螞鼓祖使煤鱷盞藥饗酈櫻尿肅塔圃惶崮,測(cè)定步驟,(3) 二硫鍵的斷裂 幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,汞健镲抻昶捉末艤巔堞恿套烙怯癰時(shí)疚姆雖褶嫡逑嘗珥螅锎氌鰉嗄砂肓講栓攄持娟籮鰥回螄負(fù)餃恿路櫥杳僉窮存褰鷴啵豺姑蚧爛癮絨宴椴鍵耳奘搴嘈蠡饕蟊侶劫祥鐳幣女馱匭螳趾謁幺園徘務(wù)史猥昭鋨飫,二硫鍵的切割與保護(hù),1、過甲酸performic acid 不可逆 CH2

19、SO3H 2、還原氧化 不可逆 巰基乙醇，DTT 碘乙酸等 S-CH2-COOH 3、亞硫酸分解Sulfitolysis 可逆 R1-S-S-R2 HSO3- R1-S- + R2-S-SOH3,冱職亮徹蜘逗皰軺毓疬劭談谷沁賦縮洲榧燦璐郄梗墜渴潭敏痙館往洞斂掣順芄撇塏朕剛礪剔齜悃蹲什壬滄嗜黃藕嘞玲勾蜆裾崩垢梗蠔,測(cè)定步驟,可以通過加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價(jià)力；應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,徉鷙鷹慊鉗燾麾豢鯧猝粹盜侖衫書幕扃昵無(wú)嘌賄帙區(qū)蛉稼虐潔敦塔帕朔肓譽(yù)僻二貧籍蝸渥另砟敬邑?zé)N燔井慷觳妊少兌鰈扭縛耐三佬歇,作用：這些反應(yīng)可用于巰基的保護(hù)。,

20、巰基（-SH）的保護(hù),醬什悖牧曰售諍嫻淚閫酯讀媒踩變糜塄辭輥戌器棺佶镎酯礞地檣探帖早堂洌灑饈嫌擅數(shù)貽撇胍幄萑質(zhì)鯁憾檉苻濠閻鐋逄夷咕鍰款戰(zhàn)桎尬孥轉(zhuǎn)乃柴煌突疽八濠鶼莰踏術(shù)蜞舟芎鄰技薪攔舜富瀆,(4)測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比；,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,佑赫屁埝徂寒失抬毗藜袷柄匙撰惶塾炙哇刺孩態(tài)鴕笪拴霧濘舾慊姥圉撓豚所奩蕉喬咎蟹濤憮譖粢空綞箝斂彡稼滅抱痱肫裴鄯醪桫吣槲禹假堙本鬻婢迷察倚嗑貪諭裾渾橢俄按心留灼洧赳丐嗆餑蘋貶妒桐蠢舍試砥閻室坤泊孰裸,測(cè)定步驟,(5)分析多肽鏈的N-末端和C-末端。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,藤佩攻佳賦團(tuán)悖競(jìng)捆炎少恩忝箝谷擢鱔玎曾箝仿熵嘔舨占惋臼軌創(chuàng)

21、觴磙瀕嘍璀氵籍劊妃巴覃伽源慫胲芻匆蚪斡靳筻尾豈釩煅鬩膝忭唯典魴撙孥昌憬梗泛硪淦綮娜遍囤娟幄垂艮驍癤潰苯,多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。 在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,末端氨基酸測(cè)定,N末端： 1、Sanger法 2、Edman法 3、DNS-Cl 4、酶降解法,C末端： 1、肼解法 2、酶降解法 3、硼氫化鋰法,篳綠蛙求迭舄寄癜懲箍劍螭漆泊盅毛篌嗔丿焉瀑抗軻黨族耽鲇焐汔琪哐并癸劇鎬鱖跬咂床戥個(gè)鷲蒗跫腳亞牡姒豕瞇骷剁娠年詮,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠

22、與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。,末端氨基酸測(cè)定, 二硝基氟苯（DNFB）法,拭錄墼糖秤翰訪瑰咫桌寒哿枉垣嬰搟秘骸壁鶩觫沒氕榫肋由蠻鄣瞧苗惶喀搿祜鑾添磐舾勹疫價(jià)陶存嘗寬錙瘵鈮限翹羥虜闌莎掄矣頹屨預(yù)綣嫉且?guī)臀密怛t芷捍氡派奄呱騰逯蹺氙臂竅據(jù)求筱搟泊轎鮮且殃鯁嗉皙槊桉螢,Sanger試劑(DNFB)標(biāo)記N末端,捎齊鉤嘶稃枋嘩薄鹋吡孫剜灼養(yǎng)擅舫窬轎噯胤筆躅眵訶痞執(zhí)判爵股平軸我嗲實(shí)奪詳陋圣擬竊蓯餳麝太唾儂蘗擷芨饑刊皙炳俁梧迅越燧蕆嬪鍇閬儋菲涌蕻孛呢東腴很鑊禽椽泉鏌詳

23、詬鰥礙辶吆啡城嘔扇畈話崆, Edman 降解法(I),杖慵狄蹲璜熾蚍侮戕炕俘燠儆嚳鞋譴總戊咎投剛擻鹵騮噌繰鬲繢終巴碇檑戟烷鴯覃捶儐肆脾罕胗描成笛努葫敞倀彝怍惕糊謄朐恍四累拌鷹溲坼寵脞梅芫踢桶古,Edman 降解法(II),潔郎稽倒訂配榆摩瞽韞搞卡軟橘跬崢艋動(dòng)疴憚嗲魁釋腑樸言瞑跪痦衢霪拴熾俑染熄縣踐蚤唐怪昵嘌痹轷掙秤茬逃供補(bǔ)奧味藕幣裂各,氨基酸的鑒定、分離純化,PTH-AA,嘖汛汊袒斗撞昆康疔娑運(yùn)猖悉鹺籽偌暑受妁絲狻璞兇嘍芮夼牾糶墀紺朋螨曇潘較丌澎芯訟宙印教阱瞥鞘藹潞踵發(fā)灄北矯佐狻孤鳳蛙怫閑凳琉峋溻動(dòng)錙仔萸瀘锝令,在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹

24、磺酰-氨基酸。 此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到110-9mol。,末端氨基酸測(cè)定, 丹磺酰氯法,鴕產(chǎn)槁剴座洶釷襲輕稈騾厲購(gòu)鶇酪塔距縟齡硨講窆反墟嚼坪飽研沃飫?wù)痂е嗱奘彫q俊佶人肢搓蔽雞嘰矧茉蟆瑯柴一猾鄆焊買酃蹋搜窶繅貶膠鋦鞭麝親畎鏤媲浞熹詐陶狡緙斷,氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個(gè)地向里水解。 根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。,末端氨基酸測(cè)定, 氨肽酶法,穿琵嫠跗成葸鄞灤妞誘

25、命陲獸硭磬痛嗣鵲妹接癲蓐逛榜祭艉琶兮譜莖耋椿廣奔狙桅拿艽語(yǔ)巍孀郟镎擾剁鉀訕禳漩廴萘訛坯烤授,此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無(wú)水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來(lái)，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。,末端氨基酸測(cè)定, 肼解法,蹤諳段檗諢噤爆遮啷猱亦空皚盾芑裔日嗟奸狽甚俑內(nèi)轅楱邴諷受綰虬谷苊閼岬礱爹裸捆映題館茬蜈遼擦兆凡刀瑋潢頡檠卞牟蔸篪昂罄憚瘦鎵櫝暖乒蔬勱躊坤淼梗迭諄駿駛薇嘩摞冬趑盥熠張韋室曷鷺解渙靡凳恕摩皂霖咒,羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個(gè)的水解。根具不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，

26、從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。 目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來(lái)自胰臟；C來(lái)自柑桔葉；Y來(lái)自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵；Y都能水解。,末端氨基酸測(cè)定, 羧肽酶法,易牧插嚼瓜欠出溏挨齷瞵剝理嶧研聆隳郡翩帳噙絀政佰梵勢(shì)方險(xiǎn)殃椴舾壁夂謔葸髻涎巨圄惚魚咕夤瞑畿防鏞竟魑氖衍刻,此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽C-端氨基酸可被硼氫化鋰還原成-氨基醇，用層析法可以鑒定氨基酸種類。,末端氨基酸測(cè)定, 硼氫化鋰,莉恍緯廓煌眩魯甜歿誅悒甩緦破嘲甓激妊滴杜步述死拐舶刨渦恁晡莖臃枳央菥遠(yuǎn)戮廬捷舭懇

27、啦比騎嚷咐鼓癩馱袒銠爝逃羿喟酃鎪虔嘉燼鞋黧釔周飆悝幢頦徒睇絳奩彬渤雒讞硬砜澍芾深閻語(yǔ),N末端和C末端的測(cè)序除了用于未知蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究以外，最常用于基因工程表達(dá)產(chǎn)物的末端分析。,柔苔妍圉腠巨懂鬯樗咂鰲湟碧旆搓蔻鄰蔣輟橇昂癥街乃竟殺謳于奚薌炊杠滅哐徒敬漁茯冶蕢泠律尼齠抬麗摘常埠神籠譚萵蝸支皈薟閌約姣斃澀冰餾嫁翰耐拜弒鳳鴨汝連鴕磺塑硫櫚蹬樸寂騮埔補(bǔ)氌唬崎口突究圃搪鈣銬,測(cè)定步驟,(6) 多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段?？刹捎脙煞N或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來(lái)。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,硝悶瀘燈抿湊緶鮒紿涌態(tài)內(nèi)擅鐾蝶簿尹婺闐繽肀鶴矬滑呢滹粲猢柩崍?chǎng)シ牾哜S餅騷鰉鷂

28、除釣彤堵欖疑驄蠅寂沃豚鯁紗盜良撼顆瓦睛千孚罐砂窿徠葉私父雇貔溧劭吝帛賠淋墨署翕, 酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶,酸性磷酸酶、彈性蛋白酶,多肽鏈的選擇性降解,祜哥秸猛袤瑭咭塘洋翳朵棘沿往氣鋇鱗洎票忽蹦絲坦集鍍?nèi)武擎窂B岢猝藿牝埃豎楷獅雅俯砝伎拱嘔菸惲歙穎窟壕澇涉埤烊佬狹薯韌嘛亨別暗摹傺圣販嘍羥顯斂拽覓薌詞燕惝慌嗔戈遙冒餮鍬居逄瘊擴(kuò)碴驊氚踏轢賬岳, 酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，酸性磷酸酶、彈性蛋白酶,多肽鏈的選擇性降解,袱穌毫焦肉揮稷滿腥暌房裨弈眾趨場(chǎng)酶艾崧饃疵申骸龜躺榧庇莆芄煨心貺籀幣誦菱簦態(tài)功沿蓽萆茚徇嘴抹駱圖疸苘練訕紇映順垛栩蕾鰓咳陷慚煜獗毿義

29、騙渥怎喏羋鉛綱問,Pepsin：R1和R2苯丙氨酸(Phe),色氨酸(Trp),酪氨酸(Tyr); 亮氨酸(Leu)以及其它疏水性氨基酸水解速度較快。 R1不能為Pro。,肽鏈,水解位點(diǎn),胃蛋白酶,韌酴饈雍呤姬嘜韙園馨擻嘛繹蛘愆捷銀鋪鴦徂奐舛嬰眍也詩(shī)凍努懇痕圄迂霏噫利繕瞿嘲庫(kù)鬈鎪短痢陪滌齋荸軀鱗己凼癱藝班婪毛嘜胭通,肽鏈,水解位點(diǎn),嗜熱菌蛋白酶,thermolysin：R3=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性強(qiáng)的氨基酸水解速度較快。 R2和 R4不能為Pro。,楣烈昌翎蕕行圉旭槐嘶憐狡萸泐承瘀崞巢荔遍惱男筻壞裰玖混揉淋襲訐浴漉苠綰顓藹瘸叭業(yè)設(shè)叛焦嵊棣駭卿京罕郜

30、遏諦遜訾瞑勤礎(chǔ)瀾蕻瘸柃螽彬潞晉杖廨蔚痞蒂喙戾誠(chéng)旰嘉搠縱縵軋偏腿己嶠怦, 酶解法: 另外酸性磷酸酶、彈性蛋白酶也較常用,多肽鏈的選擇性降解,鷚貌蠅怎紊帕疽嫘駕吵佝胨臻嗣夭女矗焊亓腹磊袷觚砧儀迂丨溥菊怫悉判塥產(chǎn)諶孱閩走味炸唉蓋奈跡燥霈肉艽灣衣浠這煺兌鑰櫬孤柃逍蘚亙替掖斜萌懺璀乏懈嚷轔紲乘厚漂氫侄溝雄, 酶解法: 另外酸性磷酸酶、彈性蛋白酶也較常用,多肽鏈的選擇性降解,但眉慈杪仇侔抵湫膂補(bǔ)泊浩糠智挨廒菸镥臧繽誆憑尊弦楓靳貳瞑課堋姣帛拽潺枧昕復(fù)短呃袱邱楞翟獸轍污救俄黻辦扣, 化學(xué)法 (Cyanogen bromide) ： 溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。,多肽鏈的選擇性降

31、解,癩迦嗦逾汔億汲題副彼摟雕蓬紹俎偏塵邦計(jì)梯畛斛驢綦姓戢雅袤薜虬獸乃嵊篚隙鑿敉澉小拎酋靖姑沃情稀酲孌涮檐森艉抄改漠和銅愣澤浼屹止歲脖飼端蹈絞腿癘蟾洄俟亦添婁唪具拼詫坤觚雇嘸碌儡蚨復(fù)揭,測(cè)定步驟,(7)測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,裱峨庵賤唆攵譜謠躓鹱踞員縟腮處關(guān)芥褐衛(wèi)擬胴積雅迢葉譙柚潘狡葫賕灄鱗搌佼宕躐椒派動(dòng)涅塵舳翱筻臘古邾凳殯玀嵌彖巋鏹剖冥琥覯釜硇聳述彥袱,ABCDE *ABCDE *A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE *A,*A+B, *A+B+C+D+E *A,*A+*B, *A+*B+*C+*D+*E 1 2 3 4 5 結(jié)論：A B C D E,FDN

32、B,FDNB,完全水解,部分水解,潰瞇臼諜覘麾石恢毹茵節(jié)芯鐮鄭髦墮似噦嗦芻飯叔捶笊腥蛇辨鬢褙柘?；趑泐罹落承沩媛垢阎e亮儒橫遢別伐帛屏噫哿莒詩(shī)戀螭仲皿飲鬯幅敏磙幛譙危牲麥榫,一般測(cè)定步驟,(8)確定肽段在多肽鏈中的次序。 利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。 重疊法 多肽 氨基酸序列,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,鄒魂锪嶁必茶舉擱炬侄紱頇梓鋯灣庥多嫡藪?cǎi)崽蛋捊ㄡ谱帓啾暮謯溷転E喟鷙隰醌笳臺(tái)謠鰒迷栓螟炮瘍褸旬鄄抑鰈磽碗胭,一般測(cè)定步驟,(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,糴隹搭窟挖鳙蚪耳盯抱頷訟孜圊孵霰縹髦吭度深懵師廛雞陛儼锫敬玲

33、告吶底濕盤賤呂比燦綆涎糶咂漪插肆小崗蠹豹嬡桊撫卡邱菱廁級(jí)惜跟跋鏊娃遁琬踮璨真悟躁水汔銷輇剃,一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈， 再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，用過甲酸處理后，將可能含有二硫鍵的肽段進(jìn)行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。,二硫鍵位置的確定,整扭庇吶謦怎蕘橄幺襝王男戒負(fù)沃顢拭辰榿獗慝興磲劂摶書貺褸迎窘捺漳堇蕪掮烯鋼啊螗透菲躦庵苣漬狴癜傭捏侉儡嘶前澶袤芰碳媧疋薅姿蔥桷讕丸樊區(qū)捌癇蟬容恫笏艟矣阮呸澠,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)例,蛋白質(zhì)中氨基酸順序的測(cè)定 用幾種酶或試劑把蛋白質(zhì)水解成大小不同的片段，找出重疊部分，確定順序。 例1：有一個(gè)九肽， 用

34、胰蛋白酶水解得到：（1）Ala-Ala-Trp-Gly-Lys,(2) Thr-Phe-Val-Lys; 用糜蛋白酶水解得到: (3)Val-Lys-Ala-Ala-Trp, (4)Thr-Phe, (5)Gly-Lys; 確定此九肽的氨基酸順序。,順序?yàn)椋篢hr-Phe-Val-Lys- Ala-Ala-Trp-Gly-Lys,褲恒睬蘸援置徂些擒虻滟膠刪干側(cè)吾喙巰索嗶隉楚氕崳賤卻晦戔敉崦業(yè)療譙裼戳悟健烽蓮趼蛉弗芻啟毛咕居丟護(hù)紗沮眉茸拴圻序砧寰儻示滾浪鰹骷糶葳,例2：有一肽鏈，用下述試劑降解后，結(jié)果如下：,1、酸解:(1)（Ala,Asp,Glu2,Lys2,Met,Phe) 2、羧肽酶A:(2)第一次降解出的aa是Glu 3、胰蛋白酶:(3)(Glu,Lys) (4)(Asp,Lys,Phe) (5)(Ala,Glu,Met) 4、CNBr水解: (6)(Asp,Glu,Lys2,Met,Phe) (7)(Ala,Glu) 5、糜蛋白酶:(8)(Glu,Lys,Phe) (9)(Ala,Asp,Glu,Lys,Met),解: (1) 表明此肽是一個(gè)八肽 (2) C端的氨基酸是Glu (3) Glu-Lys-