SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)實驗原理和操作步驟

1、.sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)實驗原理和操作步驟實驗原理：sds-page是對蛋白質(zhì)進行量化，比較及特性鑒定的一種經(jīng)濟、快速、而且可重復(fù)的方法。該法是依據(jù)混合蛋白的分子量不同來進行分離的。sds是一種去垢劑，可與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合，破壞其折疊結(jié)構(gòu)，并使其廣泛存在于一個廣泛均一的溶液中。sds蛋白質(zhì)復(fù)合物的長度與其分子量成正比。在樣品介質(zhì)和凝膠中加入強還原劑和去污劑后，電荷因素可被忽略。蛋白亞基的遷移率取決于亞基分子量。試劑和器材：試劑：1. 5x樣品緩沖液（10ml）:0.6ml 1mol/l的tris-hcl(ph6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的sds，0

2、.5ml巰基乙醇打開二硫鍵的作用，1ml 1%溴酚藍，0.9ml蒸餾水?？稍?保存數(shù)周，或在20保存數(shù)月。2. 凝膠貯液：在通風櫥中，稱取丙烯酰胺30g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。過濾后置棕色瓶中，4保存，一般可放置1個月。3. ph8.9分離膠緩沖液： tris 36.3g ，加1mol/l hcl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，調(diào)ph8.9，定容至100ml， 4精品.保存。4. ph6.7濃縮膠緩沖液： tris 5.98g ，加1mol/l hcl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，調(diào)ph6.7，定容至100ml， 4保存。5. temed（四乙

3、基乙二胺）原液6.10%過硫酸銨（用重蒸水新鮮配制）7. ph8.3 tris-甘氨酸電極緩沖液：稱取tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸餾水約900ml，調(diào)ph8.3后，用蒸餾水定容至1000ml。置4保存，臨用前稀釋10倍。8. 考馬斯亮藍g250染色液：稱100mg考馬斯亮藍g250，溶于200ml蒸餾水中，慢慢加入7.5ml 70%的過氯酸，最后補足水到250ml，攪拌1小時，小孔濾紙過濾。器材：電泳儀，電泳槽，水浴鍋，搖床。 實驗操作精品.（一）樣品制備將蛋白質(zhì)樣品與5x樣品緩沖液（20ul5ul）在一個eppendorf管中混合。放入100加熱 510min，取上清點樣。（二

4、）分離膠及濃縮膠的制備1 將玻璃板、樣品梳、spacer用洗滌劑洗凈，用ddh2o 沖洗數(shù)次，再用乙醇擦拭，晾干；2 將兩塊洗凈的玻璃板之間加入spacer，按照bio-rad mini /說明書提示裝好玻璃板；3 按如下體積配制10分離膠8.0 ml，混勻；ddh2o 3.0 ml1.0 mol/ltris-hcl緩沖溶液，三羥甲基氨基甲烷 ph=8.8 2.1 ml30% acr-bis甲叉雙丙烯酰胺 2.8 ml10% sds 十二烷基磺酸鈉，使蛋白質(zhì)變性80 ul10%ap過硫酸銨，助氧化劑，加速膠的凝固 56 ultemed催化過硫酸鈉產(chǎn)生自由基，從而加速丙烯酰胺凝膠的聚合 6 ul4 向玻璃板間灌制分離膠，立即覆一層重蒸水，大約20 min后膠即可聚合；5 按如下體積配制6濃縮膠3.0 ml，混勻；ddh2o重蒸水 1.0 mol/ltris-hcl ph=6.8 30% acr-bis2.0 ml 400 ul 600 ul10% sds 10% ap temed36ul 24ul 4ul6 將上層重蒸水傾去，濾紙吸干，灌制濃縮膠，插入樣品梳；精品.7 裝好電泳系統(tǒng)，加入電極緩沖液，上樣20 l;8 穩(wěn)壓200v，溴酚藍剛跑出分離膠時，停止電泳，約需45 min1hr.9 卸下膠板，剝離膠放入染色液中，室溫染色12 hr；加入脫色液，置于80 r