8味單藥提取液體外抑制未孢子化卵囊成熟的研究設(shè)計(jì)與記錄.doc

8味單藥提取液體外抑制未孢子化卵囊成熟的研究設(shè)計(jì)與記錄篩選對(duì)未孢子化卵囊的成熟有抑制作用的中藥提取液試驗(yàn)編號(hào)： 201403 實(shí) 驗(yàn) 人： 王旭川 試驗(yàn)時(shí)間： 2014年3月 實(shí)驗(yàn)一 8味單藥的提取1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠盟宸ê途凭岱ㄌ崛?味單藥的有效成分。2、 實(shí)驗(yàn)材料2.1試劑：清水、無(wú)水乙醇2.2藥品：常山、青蒿、使君子、白頭翁、苦參、瑞香狼毒根、苦諫根皮、鉤藤2.3器具：銅質(zhì)碎藥缽，大德牌1000g高速搖擺式萬(wàn)能粉碎機(jī)（浙江溫嶺市林大機(jī)械制造有限公司）、電子天平、60目篩、砂鍋、萬(wàn)用電爐、錐形瓶、試管、容量瓶、量筒等。3、 試驗(yàn)方法3.1水煎法提?。?味單藥分別稱取10g粉碎，過(guò)60目篩，中藥粉末用清水浸泡24h，砂鍋熬煮30min，取藥液，再將剩余藥渣加適量清水再熬煮30min，將兩次得到的藥液混勻，分成兩份，其中一份添加適量滲透劑，兩種藥液分別制成含原藥5.0mg/ml的原液。再將兩種原液稀釋為0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml10個(gè)濃度。將稀釋得到的藥液裝入小瓶中密封，與剩余原液一同放入冰箱冷藏備用。3.2酒精靜置法提?。?味單藥分別稱取10g粉碎，過(guò)60目篩，中藥粉末置于錐形瓶中，倒入適量無(wú)水乙醇，塞上塞子，放入70溫箱中，24h后取出藥液冷卻，分成兩份，其中一份添加適量滲透劑，兩種藥液分別后制成含原藥5.0mg/ml的原液。再將兩種原液稀釋為0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml10個(gè)濃度。將稀釋得到的藥液裝入小瓶中密封，與剩余原液一同放入冰箱冷藏備用。實(shí)驗(yàn)二 艾美耳球蟲卵囊對(duì)雛雞的感染試驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠萌崮郯罓柷蛳x感染雛雞以便從糞便中收取大量的球蟲卵囊2、 實(shí)驗(yàn)材料2.1試驗(yàn)用品： 滴管、鑷子、剪刀、玻璃棒、錐形瓶、載玻片、桌布、牙簽、燒杯、紗布、手套等均應(yīng)在80干燥箱中烘干消毒30min。2.2飼養(yǎng)室用品：洗衣粉、刷子、汽油噴燈、汽油、塑料布、鐵絲、剪刀、氯制劑、氨水、火堿（naoh）、甲醛（1000ml）、高錳酸鉀（500ml）、水（500ml）、燈泡、報(bào)紙。2.3試驗(yàn)蟲株：柔嫩艾美爾球蟲卵囊由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室提供3、 實(shí)驗(yàn)方法3.1飼養(yǎng)室的消毒在雛雞入舍前，先移將動(dòng)物房清空，清掃干凈后，清洗，在動(dòng)物房干燥后，進(jìn)行消毒以下。3.1.1沖 先將墻壁、地面、頂棚和其它用具沖洗干凈，再用刷子將水槽、料槽和雞籠刷洗后沖洗干凈；3.1.2燒 先將地面的雞毛與糞便以汽油噴燈燒烤，再將刷干凈后雞籠用汽油噴燈火焰消毒。3.1.3噴灑 消毒要用氯制劑消毒藥噴灑地面、屋頂和墻壁，之后地面、地面以上2米的墻壁及其它所有突出墻外的附屬設(shè)施，然后用3%火堿噴霧和10氨水消毒；用氯制劑消毒藥將水槽、料槽浸泡30min以上。3.1.4熏蒸 密閉門窗，進(jìn)行熏蒸消毒（福爾馬林毫升數(shù)與高錳酸鉀克數(shù)之比為2：1。一般按福爾馬林30毫升/立方米、高錳酸鉀15克/立方米和常水15毫升/立方米計(jì)算用量。進(jìn)行熏蒸消毒時(shí)，一般舍溫不應(yīng)低于18，相對(duì)濕度以60% 80%為好，不宜低于60%。當(dāng)舍溫在26，相對(duì)濕度在80%以上時(shí)，消毒效果最好）2448h，用前通風(fēng)2448h待用。3.1.5電線、塑料布、水槽、料槽的處理80干熱放置30min以殺滅球蟲卵囊。3.1.6雞籠處理用塑料布包裹消過(guò)毒的雞籠，將40w的燈泡接于雞籠中，提前12h開啟燈泡，使溫度能均衡保持在34左右，并用干濕溫度計(jì)測(cè)定濕度，使其能均衡保持在6065%左右，準(zhǔn)備養(yǎng)雞。3.2球蟲含量檢測(cè)及攻毒劑量的確定 3.2.1用具：塑料布、生理鹽水、離心管、載玻片、玻璃棒、移液管、蓋玻片、計(jì)數(shù)板3.2.2用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算所用球蟲卵囊的含量，并對(duì)球蟲卵囊做稀釋或離心處理，并確定攻毒劑量。3.3增值方法：3.3.1用具：手套、注射器、輸液針頭、飼料、涼白開、消毒劑3.3.2健康檢查：（試驗(yàn)前） 一般采用“五點(diǎn)梅花法”取被檢動(dòng)物或動(dòng)物群的新鮮糞便l0g，進(jìn)行健康檢查。 （1）取被檢動(dòng)物或動(dòng)物群的新鮮糞便l0g，放入50ml燒杯中，加入適量水。（2）輕輕攪勻，經(jīng)60目銅絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾。（3）將濾液移入4支10 ml15 ml試管，2500rmin離心l0min。（4）傾去上清液，各管沉淀物中加入少量飽和鹽水，混勻。各管的沉淀物混懸液移入一個(gè)5ml玻璃瓶。（5）用飽和鹽水加滿，蓋上蓋玻片(蓋玻片須能與液面接觸)，靜置10min。（6）取下蓋玻片，放在載玻片上。（7）置載玻片于顯微鏡臺(tái)上，用l010或1040的倍數(shù)進(jìn)行檢查。（8）判定：如果視野中發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊，可判定為陽(yáng)性，即說(shuō)明該動(dòng)物(群)己受到球蟲的感染。未發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊，需重復(fù)檢查5次，仍未見球蟲卵囊，本糞樣可判為陰性。只有連續(xù)檢查糞便7d10d，均未發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊，方可說(shuō)明該動(dòng)物(群)未感染球蟲。3.3.3雞群攻毒：經(jīng)灌胃前五天連續(xù)鏡檢試驗(yàn)雞糞便，均無(wú)發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊后，分別對(duì)健康的 日齡小公雞以 5000個(gè)孢子化卵囊/只灌胃，具體操作：確定攻毒劑量后，將一次性輸液器管插入雞嗉囊中，用注射器將球蟲卵囊輕輕推入。灌胃后在無(wú)球蟲環(huán)境中飼喂雛雞標(biāo)準(zhǔn)料，飼料中添加1600mg/kg的土霉素和1800mg/kg的制菌磺，飼料和飲水中不能含有球蟲（高壓滅菌）。養(yǎng)雞過(guò)程中注意雞舍的清潔與衛(wèi)生，出現(xiàn)病死雞及時(shí)剖檢，查找病因。收集接種后第139168h糞便及168h盲腸中的球蟲卵囊，同時(shí)鏡檢其他腸段有無(wú)球蟲。實(shí)驗(yàn)三 球蟲卵囊的收集1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膹母腥玖巳崮郯罓柷蛳x的雞的糞便中回收球蟲卵囊2、實(shí)驗(yàn)材料 2.1試劑 洗潔精( 5ml ) 生產(chǎn)廠家：廣州立白企業(yè)集團(tuán)有限公司 批號(hào)：70140215k70118乙酸(5ml)生產(chǎn)廠家：太原溶劑廠 批號(hào)：hg3-1095-77、食鹽生產(chǎn)廠家：山西省鹽業(yè)公司 批號(hào)：gf610802100095、涼開水(1桶) 2.2用品和儀器：天平(hc-tp12a-20)，玻璃棒（4個(gè)）、18目篩（1mm）、80目篩（孔徑約0.2mm）、200目篩（孔徑約0.075mm）、離心機(jī)3個(gè)（dd5m aida）（anke lxj-iib）（lxj-）、燒杯15個(gè)、15ml離心管6支、血球計(jì)數(shù)板1個(gè)、麥卡瑪斯特計(jì)數(shù)板1個(gè)、溫箱(xmtd mc12810132)、顯微鏡（xsp-24n no.022724）、滴管3個(gè)、載玻片若干、蓋玻片若干。2.3分離液配制配方：含0.5的洗潔精和2.5%乙酸、滅菌水；配制過(guò)程：取一個(gè)500ml的燒杯按順序加入462.7ml滅菌水（涼白開水）+2.5ml洗潔精+33.8ml乙酸。3 實(shí)驗(yàn)方法和步驟3.1糞便的收集和處理：將新鮮糞便先用少量生理鹽水浸濕，并攪開糞塊，然后用10倍的生理鹽水浸泡并不時(shí)地?cái)嚢?，直到糞便中的卵囊大部分溢出到水中（大約1小時(shí)）。先用60目篩過(guò)濾，后用200目篩過(guò)濾糞便，過(guò)濾三次。第一次過(guò)濾后剩余糞便用5倍于糞便的生理鹽水稀釋并攪勻后再過(guò)濾，第二次過(guò)濾后剩余糞便用3倍于糞便的生理鹽水稀釋并攪勻后再過(guò)濾。取盲腸內(nèi)容物：用剪刀將盲腸縱向剪開，刮取盲腸內(nèi)容物置于離心管中。將盲腸置于盛有適量生理鹽水的研缽中輕研磨、沖洗（重復(fù)三次）。并將每次的洗液倒入離心管中。3.2糞便濾液或盲腸內(nèi)容物懸浮液的處理：將上述得到的糞便濾液或盲腸內(nèi)容物懸浮液放到離心管里，加生理鹽水到離心管的3/4，并加入0.5的洗潔精。2000r/min離心10分鐘，檢上清，無(wú)球蟲時(shí)棄上清（將上清倒入另外高壓過(guò)的離心管里進(jìn)行檢測(cè)）；于沉渣中加少量生理鹽水并將沉渣攪開，再加生理鹽水到離心管的3/4，離心，重復(fù)洗3次。3.3球蟲卵囊的漂浮：向上述離心所得的沉淀中加10倍量飽和鹽水（比重1.18）（先加少許，混勻后再加其余的），1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集上清液；再重復(fù)漂浮12次，檢查沉渣，當(dāng)沉渣中沒有或僅有少量球蟲時(shí)，棄掉沉渣。最后把離心所得飽和食鹽水混合。3.4球蟲卵囊的沉淀：將上述上清液用生理鹽水7倍稀釋，2500r/min離心10分鐘，檢上清，無(wú)球蟲時(shí)棄上清，收集沉淀物（卵囊）。卵囊計(jì)數(shù)每ml濾液卵囊數(shù)計(jì)數(shù)方法稱取10ml濾液。取50ml飽和鹽水，加入10ml濾液中。混勻，用吸管吸取少量混合液體，加入計(jì)數(shù)室內(nèi)（液體要充滿計(jì)數(shù)室但不要溢出），放于顯微鏡載物臺(tái)上，靜置12分鐘。在低倍鏡下（1010）數(shù)完兩個(gè)計(jì)數(shù)室內(nèi)見到的全部蟲卵，取平均值乘以40，即為每ml濾液中的蟲卵數(shù)。在分離的卵囊中加入少量（約0.6ml/只雞）2.5%重鉻酸鉀溶液攪勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用2.5%重鉻酸鉀溶液將卵囊稀釋為1.0105個(gè)/ml溶液。3.5培養(yǎng)與保存：取一部分收集到的未孢子化卵囊的重鉻酸鉀溶液用作中藥提取液抑制未孢子化卵囊成熟率的試驗(yàn)，同時(shí)將剩余卵囊液放到28溫箱中通氣培養(yǎng)，并觀察孢子發(fā)育情況。當(dāng)完成孢子化卵囊達(dá)到85的時(shí)，停止培養(yǎng)；貼標(biāo)簽后4冰箱保存（不要靠近冰箱后壁），同時(shí)于蟲株登記記錄本登記批號(hào)與收集量。在保存時(shí)，糞便和盲腸的卵囊要分開保存。每次操作后對(duì)離心機(jī)、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、地面和隔離器等清理干凈后除采用常規(guī)消毒外，再用10%氨水消毒1h以上。實(shí)驗(yàn)四 8味單藥對(duì)體外未孢子化卵囊成熟率的影響1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹荚谕ㄟ^(guò)8味單藥提取液對(duì)體外未孢子化卵囊成熟率的影響的試驗(yàn)篩選出抑制效果較好的幾種單藥提取液的幾個(gè)相應(yīng)的濃度2、實(shí)驗(yàn)材料2.1試劑：水煎法提取得到的添加滲透劑和為添加滲透劑的八味單藥的0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml10個(gè)濃度的藥液，酒精靜置法提取得到添加滲透劑和為添加滲透劑的的八味單藥的0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml10個(gè)濃度的藥液。2.2蟲株：實(shí)驗(yàn)三收集到的每毫升1.0105個(gè)柔嫩艾美耳球蟲未孢子化卵囊的重鉻酸鉀溶液。2.3用具：青霉素小瓶若干、微量移液槍兩只、血球計(jì)數(shù)板1個(gè)、麥卡瑪斯特計(jì)數(shù)板1個(gè)、溫箱(xmtd mc12810132)、顯微鏡（xsp-24n no.022724）、滴管3個(gè)、載玻片若干、蓋玻片若干。3、實(shí)驗(yàn)方法3.1水煎劑組：在試管中分別配置質(zhì)量濃度為0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml的8味單藥藥液1 ml，每樣平行設(shè)3管，并設(shè)不加藥物空白對(duì)照組。于每支試管內(nèi)分別加入1 ml每毫升含1.0105個(gè)未孢子化柔嫩艾美爾球蟲卵囊懸液，在2728溫箱培養(yǎng)，于 h、 h計(jì)數(shù)卵囊的孢子化率。3.2加滲透劑水煎劑組：在試管中分別配置質(zhì)量濃度為0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml的8味單藥藥液1 ml，每樣平行設(shè)3管，并設(shè)不加藥物空白對(duì)照組。于每支試管內(nèi)分別加入1 ml每毫升含1.0105個(gè)未孢子化柔嫩艾美爾球蟲卵囊懸液，在2728溫箱培養(yǎng)，于 h、 h計(jì)數(shù)卵囊的孢子化率。3.3酒精靜置組：在試管中分別配置質(zhì)量濃度為0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml的8味單藥藥液1 ml，每樣平行設(shè)3管，并設(shè)不加藥物空白對(duì)照組。于每支試管內(nèi)分別加入1 ml每毫升含1.0105個(gè)未孢子化柔嫩艾美爾球蟲卵囊懸液，在2728溫箱培養(yǎng)，于 h、 h計(jì)數(shù)卵囊的孢子化率。3.4加滲透劑酒精靜置組：在試管中分別配置質(zhì)量濃度為0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml的8味單藥藥液1 ml，每樣平行設(shè)3管，并設(shè)不加藥物空白對(duì)照組。于每支試管內(nèi)分別加入1 ml每毫升含1.0105個(gè)未孢子化柔嫩艾美爾球蟲卵囊懸液，在2728溫箱培養(yǎng)，于 h、 h計(jì)數(shù)卵囊的孢子化率。4、 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)4.1水煎劑組濃度mg/ml藥物常山青蒿苦參鉤藤白頭翁使君子苦諫根皮瑞香狼毒空白對(duì)照