總糖和還原糖的測(cè)定.ppt

實(shí)驗(yàn)一、總糖和還原糖的測(cè)定 3,5-二硝基水楊酸法,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、掌握還原糖和總糖測(cè)定的基本原理； 2、學(xué)習(xí)用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖的方法。,二、實(shí)驗(yàn)原理,還原糖是指含有自由醛基或者酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖；利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來(lái)；對(duì)沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測(cè)定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計(jì)）。,還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。,在過(guò)量的NaOH堿性溶液中， 3-氨基-5-硝基水楊酸呈橘紅色，在540nm處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與光吸收值成線性關(guān)系。利用比色法，在540nm 波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值，查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。,三、實(shí)驗(yàn)器材,1、材料：山芋粉 2、儀器：電子分析天平、水浴鍋、V-1100可見分光光度計(jì)、移液器 3、其他：試管、容量瓶、三角燒瓶、量筒、吸管（移液管）、洗耳球、玻棒、洗瓶、漏斗、離心管、六凹反應(yīng)盤、pH試紙（114）,四、實(shí)驗(yàn)試劑,1、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（1.0mg/ml） 2、DNS試劑 3、6mol/L HCl 4、6mol/L NaOH 5、I2-KI溶液,五、操作,1、樣品中還原糖的提取 準(zhǔn)確稱取0.5g山芋粉置于100ml三角燒瓶中,加3ml蒸餾水，調(diào)成糊狀 再加30ml蒸餾水,50水浴，30min (不時(shí)攪拌),轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，4000rpm，5min,上清液1,沉淀,加20ml蒸餾水，洗滌沉淀，4000rpm，5min,上清液2,沉淀(棄),置于容量瓶中，蒸餾水定容至100ml,混勻，取1ml即可進(jìn)行還原糖的測(cè)定。,2、樣品中總糖的水解、提取,準(zhǔn)確稱取0.2g山芋粉置于100ml三角燒瓶中,加3ml蒸餾水，調(diào)成糊狀 再加12ml蒸餾水，5ml 6mol/L HCl,沸水浴，30min (不時(shí)攪拌),取12滴于六凹反應(yīng)盤中，加1滴I2-KI溶液，如果完全不顯藍(lán)色，即可進(jìn)行下面的操作。,冷卻至室溫,用6mol/L NaOH調(diào)pH7.0（ pH試紙）,蒸餾水定容至100ml,混勻,濾紙過(guò)濾，取10ml濾液用蒸餾水定容至100ml，成稀釋1000倍的總糖水解液，混勻,取1ml總糖水解液，測(cè)定其還原糖的含量,3、制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及還原糖、總糖含量的測(cè)定。 取8支潔凈的試管，分別用記號(hào)筆標(biāo)上07號(hào)，按照下表進(jìn)行操作。其中05管，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作,以吸光度為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線（用Excel表制作）。,六、計(jì)算 C1V1 (還原糖)=100% m1 C2V2 (總糖)=0.9100% m2,附：相關(guān)儀器使用 1、移液管的使用 2、移液器的使用 3、離心機(jī)的使用 注意配平，對(duì)稱放 4、V-1100可見分光光度計(jì)的使用 比色皿,V-1100可見分光光度計(jì),開機(jī)預(yù)熱30min 測(cè)吸光度 選擇波長(zhǎng)（540nm） MODE鍵切換到T，將黑體放入光路中,合上蓋，