（植物學(xué)專業(yè)論文）植物激素對附子生長特性和品質(zhì)影響的研究.pdf

西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第1 頁 摘要 附子是我國傳統(tǒng)中藥和四川地道性藥材 為毛莨科烏頭屬烏頭 a c o n i t u m c a r m i c h a e l id e b x 的子根 具有重要的藥用價值 針對植物激素在農(nóng)業(yè)上的 應(yīng)用取得了重要成果 采用江油主栽品種為材料 2 0 0 7 2 0 0 8 年在西南科技大 學(xué)校園內(nèi)進(jìn)行大田試驗 研究了在苗期和子根膨大期噴施g a i a a 6 b a k t n a a 和清水對附子農(nóng)藝性狀 生理指標(biāo)和品質(zhì)的影響 以期在改善附子 生長發(fā)育和農(nóng)藝性狀 提高豐產(chǎn)性和品質(zhì) 附子g a p 栽培等提供依據(jù) 為植 物激素在藥用植物中的應(yīng)用提供范例 取得的主要研究結(jié)果如下 1 g a n a a i a a 對附子的株高 葉片數(shù) 莖圍 總生物量 子根生 物量和莖葉生物量在發(fā)育的過程中有明顯的增加作用 激素對附子各組織中 的含水量 干物質(zhì)率 子根個數(shù)的影響不大 激素對附子子根產(chǎn)量有較大影 響 有明顯增產(chǎn)作用 g a i a a n a a 對子根和1 2 子根產(chǎn)量有明顯的增產(chǎn) 效應(yīng) 相關(guān)性分析和聚類分析表明 g a i a a n a a 對附子的農(nóng)藝性狀影響 最大 6 一b a 和k t 的作用不明顯 2 激素對葉綠素 c a t p o d 和脯氨酸都有影響 但激素作用的規(guī)律性 不強 激素對g p t 和g o t 的影響有差異性 兩種酶的活性在發(fā)育過程中呈現(xiàn) 上升趨勢 3 激素處理后附子子根中淀粉 游離氨基酸 可溶性蛋白質(zhì) 總糖 可 溶性糖和多糖的含量有顯著的影響 收獲時不同組織中烏頭類總生物堿含量 也不同 子根 莖葉 須根 母根 激素對附子不同組織中烏頭類總生物堿的含 量有影響 但對整個植株中的總生物堿的含量影響不大 激素對附子不同組 織中新烏頭堿 烏頭堿和次烏頭堿的含量也有明顯的差異性 附子不同部位的附子靈含量中子根中最高 須根次之 莖葉中的含量最 低 母根的含量略高于莖葉 激素對不同組織中的附子靈含量的影響也有顯 著的差異性 關(guān)鍵詞 附子植物激素生物堿附子靈高效液相色譜質(zhì)譜 西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 第1 i 頁 a b s t r a c t r a d i xa c o n i t il a t e r a l i sp r e p a r a t ai sac h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c a lh e r b w h o s eo r i g i n a l p l a n ti sa c o n i t u mc a r m i c h a e l id e b x i t st h ec h i l dt u b e r s o f a c o n i t u mc a r m i c h a e l id e b x r a d i xa c o n i t i h a st h eh i g hm e d i c a lv a l u e t h ep l a n t h o r m o n e sh a so b t a i n e dt h ei m p o r t a n tr e s u l t so nt h ea g r i c u l t u r e t h ee x p e r i m e n t w h i c hu s e dt h em a i ns p e c i e so fj i a n g y o uw a sc a r r i e do u to nt h ec a m p u so f s o u t h w e s tu n i v e r s i t yo fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g yi n2 0 0 7 2 0 0 8 t h et h e s i ss t u d y e d t h ee f f e c t so na g r o n o m i cc h a r a c t e r i s t i c s p h y s i o l o g i c a lp a r a m e t e r sa n dq u a l i t yo f r a d i xa c o n i t i a f t e rs p r a y i n gg a i a a 6 b a k t n a aa n dw a t e ra tt h es e e d l i n g g r o w i n gp e r i o da n dt u b e r se x p a n d i n gp e r i o d t h eo b j e c t i v e sw a si m p r o v et h e a g r o n o m i cc h a r a c t e r i s t i c s i n c r e a s ey i e l da n dp r o v i d eab a s i sf o rt h ec u l t i v a t i o no f g a po fr a d i xa c o n i t i i ta l s op r o v i d eae x a m p l ef o rt h ep l a n th o r m o n e sa p p l i c a t i o n o nt h eo t h e rm e d i c i n a lp l a n t s t h em a i nt e s t sr e s u l t sa sf o l l o w 1 g a n a aa n di a a h a ds i g n i f i c a n te f f e c t so nt h ep l a n th e i g h t 1 e a v e sn u m b e r s t e mg i r t h t o t a lb i o m a s s b i o m a s so fc h i l dt u b e ra n db i o m a s so fs t e m sa n d l e a v e so fr a d i xa c o n i t i i nt h eg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t t h ee f f e c t so fh o r m o n e s o nt h ew a t e rc o n t e n ta n dd r ym a t t e r p e r c e n t a g ei nd i f f e n e r tt i s s u e sa n dc h i l dt u b e r s w e r en o ts i g n i f i c a n t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tg a i a aa n dn a ah a ds i g n i f i c a n t e f f e c t so nt h ei n c r e m e n to fy i e l d so ft h e1 2c h i l dt u b e r sa n dt u b e r s i ta l s o s h o w e dt h a tg a n a aa n di a ah a do b v i o u se f f e c t so nt h ea g r o n o m i cc h a r a c t e r i s t i c s b u t6 b aa n dk th a dn o tb ya n a l y s i so fc o r r e l a t i o na n dc l u s t e r 2 a l lt h eh o r m o n e sh a dt h ee f f e c t s o nt h ec h l o r o p h y l l c a t p o da n d p r o l i n e b u tt h er e g u l a r i t yw a sn o to b v i o u s t h ee f f e c t so fh o r m o n e so nt h eg p t a n dg o tw a ss i g n i f i c a n t t h ea c t i v i t i e so fg p ta n dg o tw a si n c r e a s e di nt h e g r o w t ha n dd e v e l o p m e n t 3 e f f e c t so fp l a n th o r m o n e so nt h ed e t e r m i n a t i o no fs t a r c h t o t a la m i n oa c i d s s o l u b l ep r o t e i n t o t a ls u g a r s o l u b l es u g a ra n dp o l y s a c c h a r i d eo fc h i l dt u b e r sw e r e o b v i o u s t h et o t a la l k a l o i d sc o n t e n ti nd i f f e r e n tt i s s u e sa th a r v e s tw a s c h i l d t u b e r s s t e m sa n dl e a v e s f i b r o u st u b e r s m o t h e rt u b e r s i th a sn o te f f e c t so nt h e t o t a la l k a l o i d so ft h ep l a n t t h ed e t e r m i n a t i o no fa c o n i t i n e m e s a c o n i t i n ea n d h y p a c o n i t i n ei nd i f f e r e n tt i s s u ea f t e rs p r a y i n gd i f f e r e n th o r m o n e sh a dt h eo b v i o u s 西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第1 i i 頁 d i f f e r e n c e t h ec o n t e n to ff u z i l i n ei nd i f f e r e n tt i s s u e sw a s c h i l dt u b e r s f i b r o u st u b e r s m o t h e rt u b e r s s t e m sa n dl e a v e s t h ee f f e c t so fp l a n th o r m o n e so nt h ed e t e r m i n a t i o no ff u z i l i n ei nd i f f e r e n tt i s s u e so fr a d i xa c o n i t i w a ss i g n i f i c a n t k e yw o r d s r a d i xa c o n i t il a t e r a l i sp r e p a r a t a p l a n th o r m o n e s a l k a l o i d s f u z i l i n e h p l c m s 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研 究成果 盡我所知 除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外 論文中不包含其他 人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果 也不包含為獲得西南科技大學(xué)或其它教育機構(gòu) 的學(xué)位或證書而使用過的材料 與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均 已在論文中作了明確的說明并表示了謝意 簽名 日期 關(guān)于論文使用和授權(quán)的說明 本人完全了解西南科技大學(xué)有關(guān)保留 使用學(xué)位論文的規(guī)定 即 學(xué)校有權(quán) 保留學(xué)位論文的復(fù)印件 允許該論文被查閱和借閱 學(xué)?？梢怨荚撜撐牡娜?或部分內(nèi)容 可以采用影印 縮印或其他復(fù)制手段保存論文 保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定 簽名 導(dǎo)師簽名 日期 西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第l 頁 1 緒論 附子為毛莨科植物烏頭 a c o n i t u mc a r m i c h a e l id e b x 的子根 味辛 熱 有毒 入心 脾 腎經(jīng) 始載于 神農(nóng)本草經(jīng) 被譽為 回陽救逆第一品藥 主要分布于四川 陜西 安徽等地 多為栽培品種 野生種多分布于長江中 下游地區(qū) 附子作為傳統(tǒng)中草藥 具有回陽救逆 補火助陽 散寒之功效 用以 陽 衰欲脫 身涼肢冷脈微欲絕 陽痰 宮冷 心腹冷痛 虛含吐瀉 陰含水腫 陽虛外感 寒濕痹痛 等癥狀 現(xiàn)代藥理研究表明 附子具有強心 抗炎 抗腫瘤 抗衰老 鎮(zhèn)靜 鎮(zhèn)痛 提高免疫力 抗癌等作用 附子的主要有效 成分為烏頭類生物堿 烏頭堿 a e o n i t i n e 新烏頭堿 m e s a c o n i t i n e 與次烏頭堿 h y p a c o n i t i n e 等 除此之外 附子的多糖成分具有降低胰島素的作用 水溶部 分具有治療內(nèi)毒素休克的作用 浸出液具有抑菌作用 1 2 1 1 1 附子生物學(xué)特性 附子為多年生草本 高6 0 1 5 0 c m 塊根通常2 個 栽培時可達(dá)4 1 5 個 呈倒卵圓形至倒卵形 莖直立 圓柱形 葉互生 葉片卵圓狀五角形 堅紙質(zhì)或略革質(zhì) 掌狀三裂幾達(dá)基部 總狀圓錐花序 花藍(lán)紫色 花瓣盔形 雄蕊多數(shù) 心皮3 5 離生 瞢莢果長圓形 3 1 花期9 1 0 月 果期1 0 1 1 月 染色體基數(shù)為8 a c a r m i c h a e l id e b x 為八倍體 2 n 6 4 國內(nèi)研究 4 5 發(fā)現(xiàn)有 六倍體和八倍體 2 n 4 8 6 4 楊親二研究發(fā)現(xiàn)了我國的栽培品種有四倍體 2 n 3 2 6 1 1 1 1附子發(fā)育特性 附子為烏頭的子根 從發(fā)育來源上 附子實質(zhì)上是一個具有膨大主根的 更新芽 川烏附子和北烏頭附子的研究進(jìn)一步證實了這一點 7 1 附子是兼 塊根無性繁殖和種子有性繁殖兩種方式的植物 但是在栽培上藥農(nóng)多用無性 繁殖 附子在四川1 2 月中旬栽種后 須根首先生長 2 月中旬植株出苗 莖 葉開始生長 不定根開始發(fā)生并形成子根 3 4 月植株莖 葉生長加快 子 根大量形成 是植株營養(yǎng)器官生長的關(guān)鍵時期 5 7 月 子根迅速膨大 根 莖 葉生長最快 生物量增長最多 是植株獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵階段一直持續(xù)2 個月 葉面積 子根數(shù) 須根量等達(dá)生長周期最大值 是子根的最佳收獲期 植株開始抽苔 孕育花蕾 根 莖 葉生長和塊根膨大減慢 進(jìn)入生殖生長 階段 8 月中旬 子根和植株生物總量達(dá)生長周期最大值 7 8 月是花粉和 西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第2 頁 子房發(fā)育的關(guān)鍵時期 9 月中旬植株開花 形成果實 1 1 月中旬后 果實成 熟 瞢熒果裂開 種子脫落 根 莖 葉 花 果實等主要器官的生長和發(fā) 育依次發(fā)生和交替建成 主要性狀的生物量可建立有效的生長曲線 表現(xiàn)為 典型的s 曲線 9 1 1 1 2 附子的種類和分布 烏頭屬植物全球約有3 5 0 余種 在亞洲 歐洲和北美洲的亞熱帶和溫帶 地區(qū)都有分布 我國烏頭屬植物約1 6 0 余種 分布于除海南以外的各省區(qū) 主要分布于云南北部 川西和藏東部的高山地帶區(qū) 東北各省及河北 山西 內(nèi)蒙古等亦有較大量分布 在四川有大量的栽培 有附子的中藥材生產(chǎn)質(zhì)量 管理規(guī)范 g a p 種植基地 在長白山地區(qū)近年有較大量栽培 我國烏頭屬植物 分為三個亞屬 牛扁亞屬 烏頭亞屬和露蕊烏頭亞屬 1 0 其中烏頭亞屬植物 品種約1 4 7 種 牛扁亞屬約2 1 種 露蕊烏頭亞屬只有1 種 烏頭屬藥用植物 如附子 川烏 主要來源于烏頭亞屬 1 2 附子的主要活性成分 附子在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛 歷史悠久 早在 神農(nóng)本草經(jīng) 中就 有附子的記載 傷寒論 金匾要略 中的很多方劑也含附子 以后歷代本 草書中大多有附子的記載 附子的化學(xué)成分的研究主要集中在二十世紀(jì)七 八十年代 該項研究主要體現(xiàn)在對該植物化學(xué)成分的提取 分離及鑒定三個 方面 1 2 1 生物堿類 過去人們研究結(jié)果表明其主要活性成分為生物堿 其中大多是二萜型生 物堿 包括c 1 8 c 1 9 和c 2 0 三大類 其中c 1 9 類型屬去甲基二萜生物堿 大部 分含有1 2 個酯化的醇羥基 酯基多由醋酸 苯甲酸及其衍生物或黎蘆酸等構(gòu) 成 雙酯型生物堿毒性很大 為該類植物中主要毒性和活性成分 在炮制或 進(jìn)入機體的過程中轉(zhuǎn)化產(chǎn)物比較復(fù)雜 我國學(xué)者從六十年代開始研究 國內(nèi) 外也都有報道 其公認(rèn)的代表性烏頭生物堿為烏頭堿的結(jié)構(gòu) 圖1 1 研究 成果如下 1 9 6 5 年 陳燕等報道從附子中分離得到次烏頭堿 h y p a c o n i t i n e 烏頭堿 a c o n i t i n e 新烏頭堿 m e s a e o n t i n e 塔拉地薩敏 t a l a t i s a m i n e l 以及兩 種新生物堿 川烏堿甲和川烏堿乙 k a r a k o l i n e u i 1 9 6 6 年 日本學(xué)者巖佐準(zhǔn)三 等從我國產(chǎn)烏頭中又分離出卡烏頭堿 c a r m i c h a e l i n e 1 2 1 1 9 7 8 年 日本今野 西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第3 頁 等從北海道伊達(dá)產(chǎn)的附子中分離一種具弱強心作用的昆常堿 1 2 1 9 8 2 年陳泗 英等又從附子中分得到尼奧靈 n e o l i n e 宋果靈 s o n g o r i n e 附子靈 f u z i l i n e 即為1 5 一q o hn e o l i n e d 3 1 1 9 7 6 年 在附子的水溶性成分中 k o s u g e 等首先 從日本附子中分離出有強心作用的微量有效成分d 1 一去甲烏藥堿 d e m e t h y l c o c l a n r i n h i h e n a m i n e 2 1 隨后 在19 8 2 年 陳迪華等從附子中分得 了去甲烏藥堿的類似物 只是在c 環(huán)上多一個 o h 以及去甲豬毛菜堿 s a l s o l i n o l 簡稱s a d m j 1 9 8 2 年 k o n n oc 1 5 等從中國附子中還得到了 圖卜1 烏頭堿結(jié)構(gòu)式 f i g 1 1 s t r u c t u r a if o r m u i ao fa c o n i t ir e m o n o a c e t yi t a l a t i s a m i n e s e n b u s i m ea b c 及四個脂類生物堿l i p o a c o n i t i n e l i p o h y p a c o n i t i n e l i p o m e s a c o n i t i n e l i p o d e o x y a c o n i t i n e o 19 8 3 年周遠(yuǎn)鵬報道 附子中含有苯甲酰烏頭原堿 b e n z o y l a c o n i n e 苯甲酰中烏頭原堿 b e n z o y l m e s a c o n i n e 苯甲酰次烏頭原堿 b e n z o y l h y p a c o n i n e 1 6 3 1 9 8 4 年 王 潔之 韓公羽從江油附子中分離得到海帕烏頭堿 美沙烏頭堿 卡拉可林 北烏頭堿 同是也分離得到了烏頭堿 附子靈等7 中二萜類生物堿 1 7 k o n n o 等從日本附子中還得到另一種心血管活性物質(zhì) 氯化甲基多巴胺 c o r y n e i n e c h l o r i d e 具有明顯的升壓和強心作用 1 8 1 1 9 8 4 年 橫田正賓從江油附子中分離 得到消旋去甲烏藥堿 h i g e n a m i n e 0 2 1 9 9 2 年張衛(wèi)東等又分離得到新江油烏 頭堿 n e o j i a n g y o u c o n i t m e 尿嘧啶 華北烏頭堿 黃草烏頭堿 19 1 楊華元等分 得附子亭 f u z i t i n e 2 0 1 1 9 9 5 年王憲楷等又得到一種新生物堿n c h oc 1 9 二萜 生物堿 2 1 1 四川江油產(chǎn)的附子中脂溶性部分有烏頭堿 美沙烏頭堿中烏頭堿按 新 西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第4 頁 烏頭堿 海帕烏頭堿 尼奧靈 卡拉可林 北烏堿 附子靈 水溶性部分可 得到新江油烏頭堿 宋果靈鹽酸鹽 附子亭 及具有強心活性的尿嘧啶 也 得到川烏堿乙 尼奧靈 其中新江油烏頭堿和附子亭為新化合物 北烏堿 宋果靈鹽酸鹽和尿嘧啶為首次發(fā)現(xiàn) 2 2 1 附子中除生物堿外 還含有附子脂酸 附子磷脂酸鈣 1 3 谷甾醇 脂肪酸酯 多糖等成分 附子靈 f u z i l i n e 是附子中二萜生物堿的主要成分之一 云南大理栽培的川 烏所加工的附片毒性低而療效較好 1 9 8 2 年陳泗英等首次從大理栽培的附子 中分離得到了尼奧寧 n e o l i n e 準(zhǔn)葛而烏頭堿 s o n g o r i n e 和附子靈三種成 分 并做了結(jié)構(gòu)鑒定 圖1 2 研究表明附子靈在附子的藥理藥效中有重要 的作用 1 3 隨后人們逐漸的從四j i l 江油的附子中也分離得到了附子靈 17 1 但 e t 圖卜2附子靈結(jié)構(gòu)式 f i g 1 2 s t r u c t u r a lf o r m u i ao ff u z iii n o 是人們在對附子靈的研究中側(cè)重于提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定的研究 對附子靈含 量測定的研究還未見報道 根據(jù)附子靈的結(jié)構(gòu)可知 沒有共軛結(jié)構(gòu) 沒有生 色和助色基團(tuán) 我們預(yù)試驗結(jié)果也表明附子靈的紫外吸收比較弱 這給附子 靈含量的測定帶來了困難 這可能是人們未展開含量測定的原因之一 1 2 2多糖 多糖是一種由單糖組成的天然大分子化合物 是組成生物高分子家族中 的一個最豐富多彩的成員 己知的天然多糖化合物約有3 0 0 多種 廣泛存在 干動物 植物 微生物和海藻中 如真菌多糖 植物多糖 動物多糖 藻類 多糖 細(xì)菌多糖等 2 3 1 6 0 年代前后 多糖作為廣譜免疫促進(jìn)劑引起人們極大 的興趣 人們逐漸發(fā)現(xiàn)多糖具有復(fù)雜的多方面的生物活性和功能 近年來 西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第5 頁 各地學(xué)者從多個方面對多糖的功效進(jìn)行了較為深入的研究主要體現(xiàn)在以下幾 個方面 1 對免疫系統(tǒng)的作用 包括對細(xì)胞免疫的作用 對體液免疫的作用 對細(xì)胞因子的影響 對機體第二信使水平的影響 抗腫瘤作用 抗氧化衰老 作用 抗病毒作用 抗骨髓抑制作用等 2 4 0 1 l 國內(nèi)外對于附子中有效成分的研究 主要集中在生物堿方面 有關(guān)附子 多糖的研究主要是在多糖的藥理藥效 分離純化 含量測定三個方面 1 9 8 6 年 k o n n o 報道了從同本烏頭的根中分離出了具有降血糖作用的多糖成分 3 引 結(jié)合中藥附子的多種臨床應(yīng)用和一些不能完全被生物堿成分解釋的藥理作用 表明另一類生物活性成分一多糖很可能也在烏頭屬植物的藥物治療應(yīng)用中也 發(fā)揮了重要的作用 近年來關(guān)于附予多糖的研究成為了一個新的熱點 關(guān)于 藥理作用 提取工藝和含量測定都取得了新的進(jìn)展 附子多糖成分具有降低 胰島素作用 3 3 1 藥理實驗研究 3 4 表明附子多糖對脂溶性生物堿有明顯的拮抗 作用 附子多糖與阿霉素能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡 激活并促進(jìn)t 細(xì)胞轉(zhuǎn)化和n k 細(xì)胞的殺傷活性 增強機體的免疫功能 發(fā)揮抗腫瘤的協(xié)同作用 附子多糖 作用的小鼠 能增大小鼠脾臟重量 提高了荷瘤小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力和 n k 細(xì)胞活性 提高了抑癌基因p 5 3 和f a s 的表達(dá) 并且提高了腫瘤細(xì)胞凋亡 率 附子多糖和酸性多糖有顯著的抑瘤作用 其作用機制主要是增強機體的 細(xì)胞免疫功能 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)癌基因的表達(dá) 35 1 附子多糖對運動 性疲勞恢復(fù) 3 6 降血脂作用 3 7 1 防治環(huán)磷酰胺骨髓抑制都有很好的作用 附子多糖水提工藝中加水量對附子粗多糖的提取影響最為明顯 3 3 1 其次 為提取次數(shù) 附子粗多糖定量研究多以葡萄糖為對照品 采用硫酸 苯酚法和 葸酮 硫酸法測定其中葡萄糖的含量 1 3 生物堿含量的測定方法 生物堿類成分是附子中的主要成分 關(guān)于生物堿研究較多的是含量的測 定方法 主要集中在烏頭類總生物堿 烏頭堿 酯型生物堿等成分的測定 1 3 1 烏頭類總生物堿含量的測定方法 1 中和法 中和法是測定生物堿含量的經(jīng)典方法 為1 9 9 0 年版中國藥典所采用 劉 成基等用直接滴定法和回滴定法分別測定用不同方法處理的川烏 3 8 i 結(jié)果表 明 直接滴定法終點突破不明顯 難于判斷 易產(chǎn)生誤差 而用回滴定法較 西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第6 頁 準(zhǔn)確 2 0 0 0 年版藥典亦采用回滴定法測定川烏中總生物堿的含量 2 酸性染料比色法 酸性染料比色法是利用生物堿與酸性染料反應(yīng)生成離子對 再進(jìn)行比色 測定的方法 根據(jù)所用酸性染料的不同 又分為溴麝香草酚藍(lán)法 嗅甲酚綠 法 甲橙提取比色法等 利用酸性染料比色法測定生物堿總量時 要注意符 合比爾定律的含量范圍 水相p h 的選擇 呈色的穩(wěn)定性 從穩(wěn)定性考慮 甲 橙提取比色法優(yōu)于溴甲酚綠法 溴甲酚綠法優(yōu)于溴麝香草酚藍(lán)法 3 9 4 2 l 3 導(dǎo)數(shù)分光光度法 可設(shè)定不同的求導(dǎo)階數(shù)清除干擾組分的吸收 利用導(dǎo)數(shù)分光光度法 樣 品經(jīng)乙醇提取后 不經(jīng)分離即可直接測定 測定結(jié)果與藥典法比較 無顯著 差異 但該法更靈敏 準(zhǔn)確 簡便 且提取溶劑乙醇比氯仿對人體更安全 4 3 4 4 4 交流示波極譜滴定法 1 9 9 2 年 王玉華等采用交流示波極譜滴定法 測定了草烏及那如 3 中總 烏頭生物堿的含量 此方法測定終點直觀 準(zhǔn)確 但受p h 值的影響較大 1 1 3 2 酯型生物堿含量的測定方法 1 改良鹽酸羥胺 高氯酸鐵比色法 1 9 7 7 年 國外曾報道利用酯型生物堿與羥胺反應(yīng)生成羥肟酸 再與f e 3 反應(yīng)生成紫紅色的絡(luò)合物 進(jìn)行比色的方法 錢忠直在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良 即在顯色后 加人一定量p h 值為o 5 的高氯酸水溶液 使空白無色 消除了 干擾 提高了檢出靈敏度 4 6 2 復(fù)合緩沖紙色譜 紫外比色法 1 9 6 5 年 日本學(xué)者吉田初代報道 在濾紙的不同區(qū)域涂布不同p h 值的 磷酸氫二鈉 檸檬酸緩沖溶液 以苯 石油醚 5 1 上行展開 熒光下觀察斑點位 置 剪取各部位 洗脫后比色 測定含量 4 7 3 離子選擇電極法 劉萬忠等合成四苯硼烏頭堿 制成對烏頭堿敏感的全固態(tài)電化學(xué)檢測器 對制川烏 草烏和小活絡(luò)丸中三中雙酯型烏頭生物堿總量進(jìn)行了測定 并對 西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第7 頁 烏頭堿水解動力學(xué)進(jìn)行了初步研究f 4 8 從實驗方法看 用電極法測定烏頭中 烏頭總堿的含量 方法簡便 檢測靈敏呢 快捷 重現(xiàn)性 穩(wěn)定性好 成本 廉價 烏頭堿水解產(chǎn)物對其測定無干擾 是一種很有前途的方法 1 3 3 烏頭堿含量的測定方法 利用酯型總生物堿含量作為指標(biāo)控制烏頭 附子的毒性 也不太合理 因為酯型總生物堿包括單酯型生物堿和雙酯型生物堿 而這兩種生物堿的毒 性大小不同 單酯型生物堿的毒性僅為雙酯型生物堿毒性的1 5 1 1 0 如果這 兩種生物堿的配比不同 即使相同量的酯型總生物堿也回表現(xiàn)出不同的毒性 在以往的研究中有單獨測雙酯型生物堿中烏頭堿含量的方法 1 薄層熒光法 1 9 9 1 年龐志功等利用該法測定了雪上一支蒿中烏頭堿的含量 結(jié)果與紫 外法的結(jié)果差異不大 精密度高 r s d i 3 9 回收率為9 5 8 t 4 9 1 該法靈 敏度高 分析速度快但需要特殊儀器 熒光分光光度計 2 紙上電泳分離 洗脫分光光度法 陸履雯等用氨水堿化樣品 用氯仿提取總生物堿 再用紙上電泳方法分 離出烏頭類生物堿 用紫外分光光度法 測定含量 該法烏頭堿的回收率為 9 7 3 變異系數(shù)為1 5 1 重現(xiàn)性好 分離效果好 但所需時間長 5 0 1 3 薄層掃描法 蔡寶昌等利用氨水堿化樣品 用氯仿提取總生物堿 用正己烷 醋酸乙 酯 9 5 乙醇 6 4 3 6 1 并伴有氨蒸汽為展開劑 用碘蒸汽熏法描計斑點位 置 待碘蒸汽揮發(fā)后 置2 3 0 n m 下測小耳釘烏頭堿的紫外吸收度 以積分曲 線的高度計算烏頭堿的含量 薄層掃描儀 具有專屬性強 準(zhǔn)確度高的特點 5 l 4 p v c 膜電極法 該法操作簡便 堿性水解產(chǎn)物對測定干擾少 電極的重現(xiàn)性好 如果采 用鹽酸法制備樣品 不需要采用有機溶劑提取的繁瑣過程 該法的缺點是 在方法學(xué)上還不夠成熟 需要對浸泡時間及過濾等環(huán)節(jié)迸一步考證 且制備 烏頭堿 p v c 膜電極比較麻煩 5 2 1 3 4 雙酯型生物堿含量的測定方法 西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第8 頁 僅以烏頭堿的含量為指標(biāo) 不能控制烏頭 附子的毒性 因為雙酯型生 物堿是烏頭 附子的主要毒性成分 附子中所含的毒性生物堿有烏頭堿 中 烏頭堿 次烏頭堿等多種生物堿 這些雙酯型生物堿毒性相當(dāng) 而烏頭堿只 是這些雙酯型生物堿的組分之一 因此單以烏頭堿的含量為指標(biāo) 無法真是 反應(yīng)烏頭 附子的毒性大小 而且不同產(chǎn)地的烏頭 附子中所含的雙酯型生 物堿的種類也不同 例如甘肅 廣西烏頭中只含中烏頭堿 北京烏頭中只含 中烏頭堿和次烏頭堿 四川烏頭 附子中三種生物堿都有 5 3 1 因此檢測酯型 生物堿的含量就顯的比較重要 1 雙波長薄層掃描法 雙波長薄層掃描法可以靈活選用展開劑 使烏頭堿 中烏頭堿 次烏頭 堿達(dá)到良好分離 該法具有設(shè)備簡單 操作方便 靈敏度高 分辨率強的特 點 廣泛用于中藥及其制劑的分析鑒別 54 1 趙東霞利用薄層掃描測定了通痹 止痛膠囊中烏頭堿的含量 結(jié)果表明 測定方法的平均加樣回收率為1 0 0 3 8 精密度r s d 為2 7 4 方法簡便 可行 重現(xiàn)性好 可利用本制劑的質(zhì)量控 制等 5 1 瞿發(fā)林等建立痛得安膠囊中中烏頭堿的含量測定方法 該法采用雙 波長薄層掃描法 以正己烷 乙酸乙酯 無水乙醇一氨水 1 2 8 2 5 0 5 為展開劑 碘化鉍鉀為顯色劑 測定該制劑中中烏頭堿的含量 結(jié)果顯示 線性范圍為 1 6ug 平均回收率為9 4 8 r s d 為2 0 3 方法操作簡便 結(jié)果可靠 實 用 適合該制劑中中烏頭堿的含量測定 5 6 1 2 高效液相色譜法 高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上 于6 0 年代后期引入了氣 相色譜理論而迅速發(fā)展起來的 它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而 均勻 小顆粒具有高柱效 但會引起高阻力 需用高壓輸送流動相 故又稱 高壓液相色譜法 又因分析速度快而稱為高速液相色譜法 h p l c 因其柱效高 分離好 穩(wěn)定方便 能同時測定幾種烏頭堿的含量 故應(yīng)用最多 紫外檢測 器 u v 是高效液相色譜法中最常用的檢測器 因其靈敏度高 穩(wěn)定性好 線 性范圍寬等優(yōu)點廣泛應(yīng)用 1 9 8 1 年 h i r o s h ih i k i o n 等首次在o d s 柱上 用磷酸鹽緩沖溶液 p h 2 7 一 四氫呋喃 8 9 1 1 作流動相 分離了烏頭類生物堿 5 刀 高效液相色譜法中 其 它常用的流動相系統(tǒng)有甲醇 水 氯仿 三乙胺 5 8 5 9 甲一水 氯 二乙胺 6 0 1 甲一水 乙腈 甲醇 碳酸銨 二氯甲烷 6 1 1 碳酸銨 四氫呋喃 甲醇 水 乙腈 十二烷基 西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第9 頁 磺酸鈉 6 2 1 乙腈 四氫呋喃 醋酸鉛等 烏頭堿在二氯甲烷中比較穩(wěn)定 而在甲 醇中則不穩(wěn)定 一星期就發(fā)生分解 因此在用高效液相法測定雙酯型生物堿 含量時 用二氯甲烷比較好 另外在樣品提取過程中 應(yīng)注意操作應(yīng)迅速 如果時間過長 則烏頭堿水解 影響測定結(jié)果 國內(nèi)最早使用h p l c 測定烏 頭生物堿的是王慕鄒等 6 3 l 他們在y w g c 1 8 柱上以甲醇 水 氯仿 三乙胺 7 0 3 0 2 0 1 為流動相 以甲基萘為內(nèi)標(biāo)測定了多種烏頭 草烏及其炮制品 種雙酯型生物堿含量 高效液相色譜法用樣量少 準(zhǔn)確度高 在微量分析中 占有優(yōu)勢 現(xiàn)在人們利用高效液相測定雙酯型生物堿主要集中在新烏頭堿 烏頭堿和次烏頭堿三種成分的檢測 其他成分的檢測還未見報道 3 質(zhì)譜和色譜聯(lián)用法 液相 質(zhì)譜聯(lián)用 氣相 質(zhì)譜聯(lián)用在中成藥的檢測中比較常見 在生物堿的 檢測中也有報道 質(zhì)譜和色譜聯(lián)用是目前檢測生物堿最靈敏的方法 被廣泛 用于中藥及生物樣品中烏頭堿的分析 6 4 j 王兆基 6 5 等采用液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用 法測定烏頭屬藥材及中成藥中烏頭類生物堿含量 探討了用l c m s 聯(lián)用法測 定烏頭屬藥材及有關(guān)中成藥中烏頭堿 次烏頭堿和中烏頭堿含量的方法 應(yīng) 用優(yōu)化后的實驗條件及采用多反應(yīng)檢測掃描方式 結(jié)果表明 被分析樣品中 各烏頭堿濃度在o 0 5 0 4 m g 1 范圍內(nèi) 色譜峰面積與濃度有良好的線性關(guān)系 此方法亦應(yīng)用于1 4 個不同的烏頭屬藥材及1 0 個不同的中成藥樣品中烏頭堿 含量的檢測 w a d ak a j i t 6 6 采用高效液相 大氣壓化學(xué)電離 質(zhì)譜 h p l c a p c i m s 方法對二萜類生物堿和去甲二萜類生物堿進(jìn)行定量分析 通過選擇性離 子監(jiān)測 s i m 掃描方式對考布素等生物堿進(jìn)行定量分析 證實了無性繁殖烏 頭中生物堿含量的等同性 4 電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜 電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜 e s i m s 是近年來發(fā)展起來的軟電離技術(shù) 具有高 靈敏度 特異性強 操作簡便快速等優(yōu)點 克服了液相的選擇性差和只能定 性定量考察少數(shù)化合物的缺點 已經(jīng)應(yīng)用于附子成分的定性和鑒定 6 烏頭 堿類二萜生物堿在電噴霧質(zhì)譜條件下形成質(zhì)子化分子 每個準(zhǔn)分子離子峰代 表一種生物堿 其歸屬可通過文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步確定 準(zhǔn)分子 離子峰的相對豐度可以近似地反映出同類生物堿的相對含量 所得質(zhì)譜圖在 準(zhǔn)分子離子峰的種類和豐度上具有很好的重復(fù)性 6 8 該方法在川烏 附子中 成藥中生物堿的檢測上已經(jīng)開始逐漸的應(yīng)用 6 9 7 0 西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第1 0 頁 5 高效毛細(xì)管電泳法 該法與h p l c 相比 具有分離時間更短 雜質(zhì)干擾更少 使用有機溶劑 少操作簡便等優(yōu)點 滿足烏頭類藥材分析的要求 且獲得的結(jié)果令人滿意 該法已被香港工業(yè)署組織的中藥質(zhì)量控制實驗室用做有毒中藥材的質(zhì)量管 理控制是一種很有應(yīng)用前景的分析方法 7 l 1 4 附子毒性及藥理作用 1 4 1 附子的藥理作用 1 強心作用 去甲烏藥堿是附子的強心成分之一 小管卓夫等首先從日本附子中分離 得到 并經(jīng)離體蛙心實驗證明有增強收縮力的作用 認(rèn)為是附子的強心成分 但含量甚微 藥理研究證明去甲烏藥堿為弱的1 3 腎上腺素能興奮劑 16 1 能興 奮啄鼠離體心房 增加收縮頻率 加快心率 另外從附子中分離得到的其它 一些成分也有強心活性如氯化甲基多巴胺為a 腎上腺素能受體激動劑 具有 明顯強心作用 氯化甲基多巴胺的作用與興奮神經(jīng)節(jié)或節(jié)前纖維有關(guān) 7 2 1 去 甲豬毛菜堿也有一定強心作用 是弱的b 受體興奮劑 對心率和心律的影響 實驗表明 附子能加強心肌收縮力 加快心率 增強心輸出量 增強心肌耗 氧量 降低心臟做功效率的作用 7 3 1 附子中強心成分去甲烏藥堿對心率失常 動物模型有一定的治療和預(yù)防作用 表明去甲烏藥堿可對抗緩慢型心律失常 7 4 近期有研究證實去甲烏藥堿在適當(dāng)劑量范圍內(nèi)具有明顯的正力性和正時 性作用 并伴有舒張壓輕度下降 對心率的促進(jìn)作用比多巴酚丁胺更顯著 有可能成為一種有前途的臨床心臟負(fù)荷試驗藥物 2 抗炎作用 附子的抗炎成分是二萜類烏頭堿 在不同的動物模型上也證實了烏頭堿 類生物堿的抗炎作用 趙保文 7 5 指出 附子的抗炎作用的機理主要是通過抑 制蛋清 角叉菜膠 甲醛等所致大鼠足腫脹 抑制醋酸所致毛細(xì)血管通透性 亢進(jìn) 抑制肉芽腫形成及佐劑性關(guān)節(jié)炎 3 鎮(zhèn)靜 鎮(zhèn)痛作用 具有鎮(zhèn)靜 鎮(zhèn)痛作用實驗研究表明 生附子鎮(zhèn)痛作用較好 而炮制附子 鎮(zhèn)痛作用減弱 口服生附子能抑制大鼠尾部加壓引起的疼痛和腹腔注射酒石 西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第l l 頁 酸銻鉀或乙酸引起的扭體反應(yīng) 7 6 1 而炮制附子則無此作用 結(jié)果表明附子的 鎮(zhèn)痛成分為烏頭堿類生物堿 此外 附子對神經(jīng)系統(tǒng) 對體溫有一定影響 還具有鎮(zhèn)靜作用 4 抗腫瘤作用 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡 董蘭鳳 7 7 等研究結(jié)果表明附子多糖的抑瘤機制主要 是通過增強機體的細(xì)胞免疫功能 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和上調(diào)抑癌基因的表達(dá) 等多種因素發(fā)揮抗腫瘤作用 5 抗衰老作用 張濤 7 8 j 等研究結(jié)果表明 附子能提高老年大鼠血清總抗氧化能力及抗氧 化酶活性 降低自由基代謝產(chǎn)物的含量 提高組織中酶的活性 改善細(xì)胞膜 脂的流動性 表明附子可提高機體抗自由基能力 減少脂質(zhì)過氧化 從而保 護(hù)細(xì)胞膜的完整和功能 起到延緩衰老的作用 6 其他藥理作用 附子多糖成分具有降低胰島素的作用 它的水溶部分對內(nèi)毒素休克具有 治療作用 浸出液具有抑菌作用 7 9 1 4 2烏頭類生物堿的毒性反應(yīng) 川烏 附子 草烏為烏頭屬常用中藥 民間也用同屬植物雪上一枝蒿 鐵棒錘 黃花烏頭等治療疾病 8 0 以上植物中主要成分是生物堿 其中以烏 頭堿 中烏頭堿 次烏頭堿等為主 其中烏頭堿是烏頭屬植物中存在最普遍 的 現(xiàn)在藥理學(xué)研究表明 烏頭堿具有鎮(zhèn)痛 麻醉 消炎 降壓的作用1 8 1 但其毒性強 其致死量為2 5 m g 從染毒至死亡只需8 m i n 4 h l 8 2 1 烏頭堿的小 鼠灌胃 皮下注射 腹腔注射和靜脈注射的l d 5 0 分別為1 8 m g k g 0 2 7 0 3 8 m g k g o 3 0 3 8 m g k g 和0 1 2 0 2 7 m g k g 中烏頭堿的小鼠灌胃 皮 下注射 腹腔注射和靜脈注射的l d 5 0 分別為1 9m g k g o 2 0 2 6m g k g o 2 1 一 o 3 0m g k g 和0 1 0 1 3m g k g 次烏頭堿分別為5 8m g k g 1 1 9m g k g 1 1 0 m g k g 和o 4 7m g k g 可見次烏頭堿的毒性最小 烏頭堿 中烏頭堿和次烏頭 堿的毒性作用性質(zhì)相似 中毒特征是呼吸抑制和心率失常 8 3 給小鼠靜脈注 射烏頭堿 中烏頭堿和次烏頭堿引起心率失常的劑量分別為2 0u k g 1 5ug k g 和7 2ug k g 維持時間分別為4 0 5 4 和7 m i n t 洲 烏頭類生物堿屬于二 西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第1 2 頁 萜類生物堿 以烏頭堿型為主 其c 1 8 c 1 4 的羥基常和乙酸或苯甲酸結(jié)合成 酯 這種雙酯型生物堿是烏頭屬中藥中毒性最強的成分 當(dāng)其水解掉一個酯 鍵 變成單酯型生物堿時 毒性降低 當(dāng)兩個酯鍵均水解掉 變成胺醇型生 物堿時 毒性很小 這就是中藥烏頭 附子 炮制的原理 8 5 9 2 由于烏頭堿毒性 強 中毒量與治療量接近 又因個體差異及炮制原因引起中毒死亡的事故常 有發(fā)生 烏頭堿中毒的主要臨床表現(xiàn)為口唇 舌及四肢麻木 流涎 惡心 嘔吐 頭昏眼花 面色蒼白 肢冷脈弱 進(jìn)而出現(xiàn)呼吸困難 四肢抽搐及昏 迷 尿便失禁 血壓下降或測不到 心率失?；蚩沙霈F(xiàn)嚴(yán)重心率紊亂 乃至 猝死 烏頭堿的神經(jīng)毒性的表現(xiàn)為 1 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)先興奮后抑制 嚴(yán)重 的還能引起休克 2 對周圍神經(jīng)先興奮后麻痹 3 抑制血管運動中樞 引起 血壓下降 烏頭堿對心臟的毒性最為明顯 其機理一是興奮迷走神經(jīng) 引起 竇房節(jié)抑制 房室傳導(dǎo)阻滯 從而導(dǎo)致心率減慢 二是直接對心臟的毒性作 用 引起心律失常 其心律失常的特點是多樣易變 以頻發(fā)室性早搏最常見 且為多源性 并易形成二聯(lián)律及陣發(fā)性室速 扭轉(zhuǎn)型室速 甚至發(fā)展為室顫 1 9 3 9 7 1 1 5 附子栽培研究 附子作為一種常用中藥 資源 加工炮制 化學(xué)成分 藥理藥效及安全 評價一直受到重視 但是栽培的研究相對較晚 研究的人也較少 肖小河等 9 8 9 9 對南瓜葉烏頭和花葉子烏頭在產(chǎn)量和抗性方面的研究發(fā)現(xiàn) 在總生物堿含量 和微量元素含量等內(nèi)在品質(zhì)之間無顯著差異 認(rèn)為生產(chǎn)上應(yīng)大力推廣產(chǎn)量穩(wěn) 定但抗逆性較好的花葉子烏頭類型 烏頭單株產(chǎn)量與土壤全磷 銅和鋅的含 量密切相關(guān) 而烏頭總生物堿含量則與土壤磷 銅 鐵和鋅的含量密切相關(guān) 陳辛等 l o o 對江油產(chǎn)栽培附子進(jìn)行了研究 認(rèn)為附子稈和須根的生物堿含量 高 應(yīng)加以利用 侯大斌 9j 研究了烏頭母根重量 打頂留葉 修根等栽培措施 對塊根產(chǎn)量的影響 烏頭的花為紫色或藍(lán)色 歐洲將烏頭的一個種 雙蘭菊 a c o n i t u mn a p e l l u s 開發(fā)為切花 為了提高產(chǎn)量滿足對切花和盆載的需求 對烏頭的栽培進(jìn)行了 大量的研究 1 0 卜1 0 3 花和塊根的產(chǎn)量受環(huán)境條件和種子本身質(zhì)量的影響 1 0 4 1 0 6 發(fā)現(xiàn)母株的花朵質(zhì)量對后代第二年的花朵和子根生長勢和質(zhì)量是相一致的 相應(yīng)的種用塊根 母根 的大小將對第二年的開花質(zhì)量和子根產(chǎn)量產(chǎn)生重要影 響 同時母根大小與第二年的植株高度 主花序長度 莖桿直徑和每株的花 朵數(shù)量密切相關(guān) 用于繁殖的塊根大小是影響花生長的主要因素 在塊根種 西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第1 3 頁 子大小與出芽 生長 開花和子根產(chǎn)量之間存在顯著正相關(guān) 1 0 7 1 0 8 1 因此 建 議塊根繁殖時使用小塊根 小于l o 薊 但切花生產(chǎn)時則應(yīng)使用大塊根 增加種 子塊根的大小也會增加烏頭的繁殖系數(shù) 烏頭的生長和開花還會受到日照長 度的顯著影響 長日照條件下 莖和主花序長度將會加倍 而每花序的花朵 數(shù)量也會增加 但開花時間會推遲 研究還發(fā)現(xiàn)開花后4 6 周時子根重量達(dá)到 最大 這時子根主芽開始伸長 塊根種達(dá)到3 0 4 0 9 時的花的質(zhì)量最好 而低 于5 9 時植株很少開花 小塊根 少根系量和少光照均不利于植株開花 大的 塊根種會增加子根數(shù) 小的塊根種則有利于提高生長比例 氣溫高于2 7 或 更高時 植株停止生長 在2 2 或略低時 植株生長良好 1 0 9 1 a c o n i t u m na p e l l u s 的塊根栽種深度對出芽和植株生長 莖桿高度對子根形成均有響 1 1 0 j l 附子 是兼塊根無性繁殖和種子有性繁殖兩種方式的植物 對附子的有性繁殖影響 因素的研究認(rèn)為 環(huán)境因素和群體密度對附子植物的繁殖能力影響較大 增 加群體密度有利于其提高繁殖能力 1 1 2 1 1 3 1 1 6 植物激素在農(nóng)作物上的應(yīng)用 植物從種子萌發(fā) 生根 長出枝葉到開花結(jié)實 衰老 脫落 體眠的整 個生長發(fā)育過程中 不僅需要無機物和有機物作為細(xì)胞生命活動的結(jié)構(gòu)物質(zhì) 和營養(yǎng)物質(zhì) 還需要一些特殊的有機物質(zhì)來調(diào)控體內(nèi)的各種代謝過程即植物 激素 植物激素是指在植物體內(nèi)合成 能從產(chǎn)生部位輸送到其他部位 對生 長發(fā)