(電大復(fù)習(xí))生物藥物分析(吉林大學(xué)自考)

1 藥物分析學(xué) 第一章 緒 論 一、 學(xué)習(xí)要點(diǎn) 1、掌握生物藥物的定義 2、掌握生物藥物檢驗(yàn)工作的基本程序與方法 3、熟悉生物藥物的分類 4、熟悉藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及藥典有關(guān)規(guī)定 5、了解生物藥物分析的任務(wù) 二、名詞解釋 1、生物藥物：是利用生物體、生物組織或器官等成分，綜合應(yīng)用多門學(xué)科的如生物學(xué)、生物化學(xué)等的原理和方法，特別是采用現(xiàn)代生物技術(shù)，進(jìn)行加工、制造而形成的天然生物活性物質(zhì)以及人工合成或半合成的天然物質(zhì)類似物，用于預(yù)防、治療以及診斷疾病。 2、生化藥物：從動(dòng)物、植物及微生物等生物體分離純化 得到的生化活性物質(zhì)，或者用化學(xué)合成、微生物合成及現(xiàn)代生物技術(shù)制得的生命基本物質(zhì)及其衍生物、降解物、大分子的結(jié)構(gòu)修飾物等，以及來(lái)自生物體或構(gòu)成生物體的一些基本成分。 3、生物技術(shù)藥物：用現(xiàn)代生物技術(shù)研制的藥物。 4、生物制品：一般指的是用微生物（包括細(xì)菌、噬菌體、立克次體、病毒等）、微生物代謝產(chǎn)物、原蟲(chóng)、動(dòng)物毒素、人或動(dòng)物的血液或組織等直接加工制成，或用現(xiàn)代生物技術(shù)方法制成，作為預(yù)防、治療、診斷特定傳染病或其他有關(guān)疾病的免疫制劑，包括各種疫苗、抗血清（免疫血清）、抗毒素、類毒素、免疫制劑（如胸腺肽、免疫核酸等 ）、診斷試劑等。 5、藥典：記載著各種藥品的標(biāo)準(zhǔn)，是一個(gè)國(guó)家關(guān)于藥品標(biāo)準(zhǔn)的法典，是國(guó)家管理藥品生產(chǎn)與質(zhì)量的依據(jù)，一般由國(guó)家衛(wèi)生執(zhí)行部門主持編纂、頒布實(shí)施。藥典和其他法令一樣具有約束力。 6、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（標(biāo)準(zhǔn)品）：需要在進(jìn)行測(cè)定的同時(shí)，用一已知效價(jià)的制品作為對(duì)照來(lái)校正試驗(yàn)結(jié)果，這種對(duì)照品就是標(biāo)準(zhǔn)品。在國(guó)際上將標(biāo)準(zhǔn)品分為兩類：國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和國(guó)際生物參考試劑。 國(guó)內(nèi)分為，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品和國(guó)家參考品。 7、藥物分析學(xué)科：一門研究與發(fā)展藥物質(zhì)量控制的方法學(xué)科，是整個(gè)藥學(xué)科學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)重要組成部分。藥物分析的基本任務(wù)是檢驗(yàn)藥品質(zhì) 量，保障人們用藥安全、合理、有效。 三、應(yīng)掌握的知識(shí)點(diǎn) 1、生物藥物主要包括生化藥物、生物技術(shù)藥物和生物制品等。 2、在生物藥物的生產(chǎn)過(guò)程中要對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)加控制，還要有嚴(yán)格的質(zhì)量管理規(guī)范，以確保生物藥物的均一性、有效性、和穩(wěn)定性。 3、中國(guó)生物制品規(guī)程是我國(guó)生物制品的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)法規(guī)。生物制品規(guī)程包括生產(chǎn)規(guī)程和檢定規(guī)程兩方面的內(nèi)容。 4、藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是藥品現(xiàn)代化生產(chǎn)和質(zhì)量管理的重要組成部分，是藥品生產(chǎn)、供應(yīng)、使用和監(jiān)督管理部門共同遵循的法定技術(shù)依據(jù)，也是藥品生產(chǎn)和臨床用藥水平的重要標(biāo)志。 5、對(duì)藥品質(zhì) 量控制的全過(guò)程起指導(dǎo)作用的法令性文件有 GLP、 GMP、 GSP、GCP 四個(gè)科學(xué)管理規(guī)范。 6、中國(guó)藥典的內(nèi)容：凡例，正文，附錄，索引。 7、生物藥物檢驗(yàn)的基本程序一般為取樣、鑒別、檢查、含量（效價(jià)）測(cè)定、寫出檢驗(yàn)報(bào)告等。 8、國(guó)際上將標(biāo)準(zhǔn)品分為兩類：國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和國(guó)際生物參考試劑。國(guó)內(nèi)將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也分為兩類：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品和國(guó)家參考品。 9、藥物分析的基本任務(wù)是檢驗(yàn)藥品質(zhì)量，保障人們用藥安全、合理、有效。 10、生物制品一般指是用微生物（包括細(xì)菌，噬菌體，立克次氏體，病毒等），微生物代謝產(chǎn)物，原蟲(chóng)，動(dòng)物毒素，人或動(dòng)物 的血液或組織等直接加工制成，或用現(xiàn)代生物技術(shù)方法制成，作為預(yù)防，治療。診斷特定傳染病或其他相關(guān)疾病的免疫制劑，包括各種疫苗，抗血清（免疫血清），抗毒素，類毒素，免疫制劑（如胸腺肽，免疫核酸等，診斷試劑等。如，乙肝疫苗，卡介苗，白喉類毒素，狂犬病免疫球蛋白，白蛋白，結(jié)核菌素等。 11、生物藥物的用途：（ 1）作為治療藥物（ 2）作為預(yù)防藥物（ 3）作為診斷藥物 四、重點(diǎn)與難點(diǎn) 1、生物藥物檢驗(yàn)的基本程序： （ 1）藥物的取樣 （ 2）藥物的鑒別試驗(yàn) （ 3）藥物的雜質(zhì)檢查 （ 4）藥物的安全性檢查 （ 5）藥物的含 量（效價(jià)）測(cè)定 （ 6）檢驗(yàn)報(bào)告的書寫 2、生物藥物的性質(zhì)： （ 1）在化學(xué)構(gòu)成上，生物藥物十分接近于體內(nèi)的正常生理物質(zhì)，進(jìn)入體內(nèi)后也更易為機(jī)體所吸收利用和參與人體的正常代謝與調(diào)節(jié)。 （ 2）在藥理學(xué)上，生物藥物具有更高的生化機(jī)制合理性和特異治療的有效性。 （ 3）在治療上，生物藥物具有藥理活性高、針對(duì)性強(qiáng)、毒性低、副作用小、療效可靠及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)。 （ 4）生物藥物的有效成分在生物材料中濃度都很低，雜志的含量相對(duì)比較高。 （ 5）生物藥物常常是一些生物大分子，它們不僅分子量大，組成、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且具有 嚴(yán)格的空間構(gòu)象，以維持其穩(wěn)定的生理功能。 （ 6）生物藥物對(duì)熱、酸、堿、重金屬及 pH 變化均比較敏感，各種理化因素的變化易對(duì)生物活性產(chǎn)生影響。 3、生物藥物分析與檢驗(yàn)的特點(diǎn)： （ 1）需要進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 （ 2）需檢查生物活性 （ 3）需做安全性檢查 （ 4）需做效價(jià)測(cè)定 （ 5）要用生化法確證結(jié)構(gòu) 第二章 酶分析法 一、學(xué)習(xí)要點(diǎn) 1、掌握酶活力測(cè)定的原理、方法和藥物分析實(shí)例 2、掌握酶法分析的原理、檢測(cè)方法和藥物分析實(shí)例 3、熟悉酶活力測(cè)定中應(yīng)注意的主要問(wèn)題 4、了解酶及酶分析法在生物藥物分析 中的應(yīng)用 二、名詞 1、酶活力： 指在一定條件下，酶所催化的反應(yīng)速度。 2、酶反應(yīng)速度：用單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來(lái)表示 3、酶的活性單位（國(guó)際單位為 U）：是指在 25下，以最適的底物濃度、最適的緩沖液離子強(qiáng)度以及最適的 pH 值諸條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一個(gè)微摩爾底物的酶量定為一個(gè)活性單位。酶的比活性即定位一毫克酶的活性單位。 4、取樣測(cè)定法：是在酶反應(yīng)開(kāi)始后不同的時(shí)間，從反應(yīng)系統(tǒng)中取出一定量的反應(yīng)液，并用適當(dāng)?shù)姆椒ㄍＶ蛊浞磻?yīng)后，再根據(jù)產(chǎn)物和底物在化學(xué)性質(zhì)上的差別，選用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法進(jìn)行定量分析，求得單 位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法。 5、酶偶聯(lián)測(cè)定法：用過(guò)量、高度專一的“偶聯(lián)工具酶”使被測(cè)酶反應(yīng)能繼續(xù)進(jìn)行到某一可直接、連續(xù)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確測(cè)定階段的方法。 6、酶法分析：是一種以酶為分析工具或試劑的分析方法。分析的對(duì)象可以是酶的底物、輔酶活化劑甚至是酶的抑制劑。包括終點(diǎn)測(cè)定法和反應(yīng)速度法。 7、酶活力測(cè)定：以酶作為分析對(duì)象，也就是根據(jù)需要對(duì)樣品進(jìn)行酶含量或活力的測(cè)定。 三、應(yīng)掌握的知識(shí)點(diǎn) 1、酶分析法包括酶活力測(cè)定法和酶法分析。 2、酶的反應(yīng)速度可以用單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來(lái)表示，酶的反應(yīng)速度愈快 所表示的酶活力愈高。 3、測(cè)定酶活力，可用物理法、化學(xué)法或酶分析法等方法。 4、酶的比活性定為一毫克酶的活性單位。 5、酶促反應(yīng)的基本要求是：所有待測(cè)定的酶分子都應(yīng)該能夠正常發(fā)揮它的作用。確定 酶促反應(yīng) 反應(yīng)條件時(shí)應(yīng)考慮以下因素：底物， pH 值，溫度，輔助因子，空白和對(duì)照。 6、一般選用底物的濃度 S=100Km，因?yàn)樵谶@種情況下反應(yīng)速度可達(dá)最大速度的 99%。 7、一般而言，溫度變化 1，酶反應(yīng)速度可能相差 5%左右。因此，試劑酶促反應(yīng)中，溫度變動(dòng)應(yīng)控制在 +0.1以內(nèi)。酶反應(yīng)溫度通常選用 25、 30、 37。 8、酶活力的測(cè)定方法按取樣和檢測(cè)的方式有取樣測(cè)定法和連續(xù)測(cè)定法。 9、取樣測(cè)定法常用的檢測(cè)方法有紫外 -可見(jiàn)分光光度計(jì)法，熒光分析法等。 10、 酶分析法中 連續(xù)測(cè)定法常用的檢測(cè)方法有紫外 -可見(jiàn)分光光度計(jì)法，熒光分析法、旋光度法、酶偶聯(lián)測(cè)定法以及電化學(xué)測(cè)定法和放射化學(xué)法。 11、熒光分析法的原理是如果酶反應(yīng)的底物與產(chǎn)物之一具有熒光，那么熒光變化的速度可代表酶反應(yīng)速度。 12、酶的反應(yīng)速度可以用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少或者產(chǎn)物的增加來(lái)表示，但以分析產(chǎn)物為好，因?yàn)楫a(chǎn)物從無(wú)到有，只要測(cè)定方法靈敏，準(zhǔn)確度可以很高。 13、 酶反應(yīng)進(jìn)程曲線：在反應(yīng)最初階段，底物或產(chǎn)物的變化量一般隨反應(yīng)時(shí)間而線性增加，反應(yīng)速度恒定；但是隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，曲線會(huì)逐漸彎曲下來(lái)，斜率改變，反應(yīng)速度下降。 14、真正能代表酶催化活性的是反應(yīng)初始階段的速度，即反應(yīng)初速度。 15、終點(diǎn)測(cè)定發(fā)一般采用：分光光度法，測(cè)壓量氣法，滴定法，同位素跟蹤測(cè)定法。 四、重點(diǎn)與難點(diǎn) 1、酶活力測(cè)定與酶法分析的異同 （ 1）酶法分析是以酶作為分析工具或分析試劑，用以測(cè)定樣品中一般化學(xué)方法難于檢測(cè)的物質(zhì)，這些物質(zhì)可以是酶的底物，也可以是酶的抑制劑或是酶的輔助因子； （ 2）酶活 力測(cè)定法是以酶作為分析對(duì)象，也就是根據(jù)需要對(duì)樣品進(jìn)行酶含量或活力的測(cè)定。 這兩類酶分析從原理到操作等基本相同，但是酶法分析中，被檢測(cè)化合物應(yīng)該是反應(yīng)的限制因素，而在酶活力測(cè)定中，使用的底物應(yīng)該過(guò)量。 2、酶促反應(yīng)的條件 選擇反應(yīng)條件的基本要求是：所有待測(cè)定的酶分子都應(yīng)該能夠正常發(fā)揮它的作用。 確定反應(yīng)條件時(shí)應(yīng)考慮以下因素：（ 1）底物：一般選用底物的濃度 S=100Km，因?yàn)樵谶@種情況下反應(yīng)速度可達(dá)最大速度的 99%；（ 2） pH 值：氫離子濃度能對(duì)酶反應(yīng)差生多種影響，酶反應(yīng)通常借助緩沖系統(tǒng)來(lái)控制 pH 值；（ 3）溫 度：酶反應(yīng)對(duì)溫度十分敏感，溫度變化 1，酶反應(yīng)速度可能相差 5%左右。因此，試劑酶促反應(yīng)中，溫度變動(dòng)應(yīng)控制在 +0.1以內(nèi)。酶反應(yīng)溫度通常選用 25、 30、 37。（ 4）輔助因子：有些酶需要金屬離子，有些酶則需要相應(yīng)的輔助物質(zhì)。（ 5）空白和對(duì)照：空白是指雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量，空白可不加酶或不加底物，或二者都加但是酶需要預(yù)先經(jīng)過(guò)失效處理。對(duì)照是指用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑測(cè)得的結(jié)果。 3、按取樣及檢測(cè)方法可將酶活力的測(cè)定方法分為取樣測(cè)定法和連續(xù)測(cè)定法： （ 1）取樣測(cè)定法：該方法中停止酶反應(yīng)通常采用添加酶的 變性劑的方法，常用的檢測(cè)方法有紫外 -可見(jiàn)分光光度計(jì)法，熒光分析法等。 （ 2）連續(xù)測(cè)定法：紫外 -可見(jiàn)分光光度計(jì)法，是根據(jù)產(chǎn)物和底物在某一波長(zhǎng)或波段上，有明顯特征吸收差別而建立起來(lái)的連續(xù)監(jiān)測(cè)方法；熒光分析法，原理是如果酶反應(yīng)的底物與產(chǎn)物之一具有熒光，那么熒光變化的速度可代表酶反應(yīng)速度；旋光度法，某些酶反應(yīng)過(guò)程常伴隨著旋光變化，在沒(méi)有其他更好的方法可用時(shí)，可考慮用旋光度發(fā)；酶偶聯(lián)測(cè)定法，加入的偶聯(lián)工具酶應(yīng)該高度純凈、專一而且 2 過(guò)量。 4、酶法分析中終點(diǎn)測(cè)定法原理、條件、種類 （ 1）原理：先借助酶反應(yīng)使被測(cè)物質(zhì)定 量地進(jìn)行轉(zhuǎn)變，然后在轉(zhuǎn)化完成后，測(cè)定底物、產(chǎn)物或輔酶物質(zhì)（第二底物）等的變化量，因此成為終點(diǎn)測(cè)定法。 （ 2）條件： 酶的底物特異性（專一性）； 反應(yīng)的平衡，酶反應(yīng)若平衡時(shí)分偏向進(jìn)行方向，則可方便地用終點(diǎn)測(cè)定法檢測(cè)； 反應(yīng)液中的酶量，要使酶反應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)完成，只有使用對(duì)底物親和性很大的酶即 Km 要小，酶用量必須大才能達(dá)到此點(diǎn)。 反應(yīng)產(chǎn)物抑制，如果產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)本身有抑制作用，則會(huì)妨礙反應(yīng)進(jìn)行，在這種情況下可采取將該產(chǎn)物出去或者和再生系統(tǒng)偶聯(lián)等辦法解決。 （ 3）種類： 單酶反應(yīng)定量法：測(cè)定底物減少，產(chǎn)物增加和輔酶變化量。 指示酶反應(yīng)偶聯(lián)的定量法：以脫氫酶為指示劑和以脫氫酶以外的酶作指示劑。 5、 D-葡萄糖的定量測(cè)定 2222 OHDOOHD G O D 葡萄糖醛酸葡萄糖DOHDHOH 2222 2過(guò)氧化物酶在葡萄糖氧化酶（ GOD）反應(yīng)中，葡萄糖被氧化、同時(shí)形成 H2O2，如果再和過(guò)氧化物酶反應(yīng)偶聯(lián)，可使還原型色素（ DH2）轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸蜕?D，氧化型色素 D在 270 420nm 處有吸收值，因此可以借助分光光度法測(cè)定，以此進(jìn)行葡萄糖的定量分析。 6、尿酸的定量測(cè)定 222222 OHCOOOH 尿囊素尿酸 尿酸酶 利用尿酸在 293nm 或 297nm 處具有的特征吸收性質(zhì)，通過(guò)尿酸酶反應(yīng)，根據(jù)它的吸收度的減少就可計(jì)算出尿酸量。 7、胃蛋白酶的活力測(cè)定 在實(shí)驗(yàn)條件下，胃蛋白酶催化血紅蛋白水解生成不被三氯醋酸所沉淀的氨基酸，利用水解產(chǎn)物中芳香氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸有紫外吸收，用紫外分光光度法直接測(cè)定，并計(jì)算出本品的酶活力。每 1g 檢品中含蛋白酶活力不得少于3800 單位。 （ 1）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取經(jīng) 105干燥至恒重的酪氨酸適量，加鹽酸溶液（取 1mol/L 鹽酸溶液 65mL， 加水至 1000mL）制成每 1mL 含 0.5mg 的溶液。 （ 2）供試品溶液的制備：取本品適量，精密稱定，用上述鹽酸溶液制成每 1mL約含 0.2 0.4 單位的溶液。 （ 3）測(cè)定法：取試管支，其中支各精密加入對(duì)照品溶液 1mL，另 3 支各精密加入供試品溶液 1mL，置（ 37 0.5）水浴中，保溫 5min，精密加入預(yù)熱至（ 37 0.5）的血紅蛋白試液 5mL，搖勻，并精密計(jì)時(shí)，在（ 37 0.5）水浴中反應(yīng) 10min，立即精密加入 5%三氯醋酸溶液 5mL，搖勻，慮過(guò)，取續(xù)濾液備用。另取試管 2 支，各精密加入血紅蛋白試液 5mL，置（ 37 0.5）水浴中保溫 10min，再精密加入 5%三氯醋酸溶液 5mL，其中 1 支加供試品溶液 1mL，另 1 支加上述鹽酸溶液 1mL，搖勻，慮過(guò)，取續(xù)濾液，分別作為供試品和對(duì)照品 的空白對(duì)照，采用紫外 -可見(jiàn)分光光度法，在 275nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，算出平均值 A 和SA,按下式計(jì)算： 1 8 1 . 1 910 n1g WA WAS S含蛋白酶活力（單位）每式中， WS 為 1mL 對(duì)照品溶液中含酪氨酸的量， g； W 為供試品取樣量， g； n為供試品的稀釋倍數(shù)； SA ， A 分別為對(duì)照品溶液及供試品溶液吸收度的平均值； 181.19 為酪氨酸的相對(duì)分子質(zhì)量； 10 為反應(yīng)時(shí)間， min。 在上述條件下，每分鐘能催化水解血紅蛋白生產(chǎn) 1 mol 酪氨酸的酶量，為一個(gè)蛋白酶活力單位。 8、酶法測(cè)定肝素 酶法測(cè)定肝素的原理是根據(jù)核糖核酸酶水解核糖核苷時(shí)，在 300nm 波長(zhǎng)處吸收度下降的速率被肝素抑制的特點(diǎn)（即肝素能專一地抑制核糖核酸酶），用已知肝素對(duì)其抑制程度進(jìn)行定量測(cè) 定，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而測(cè)得未知量的肝素含量。 此法簡(jiǎn)單快捷，一次能測(cè)定多個(gè)樣品，特別適用于大批量樣品的測(cè)定工作，可以作為生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量監(jiān)控。 具體方法為：取配成 5U/mL 的標(biāo)準(zhǔn)肝素溶液，按梯度吸取不同量分別加入試管中，每管加重蒸水至總體積為 2mL，再加核糖核酸溶液 核糖核酸 0.2g 溶于 100mL乙酸緩沖液（ 0.2mol/L， pH5.0） 1mL，測(cè)定前逐管加入湖塘核酸酶溶液（ 5mg 核糖核酸酶溶于 100mL 重蒸水） 1mL，混勻，立即測(cè)定。對(duì)照組以重蒸水代替肝素溶液同樣進(jìn)行。待測(cè)樣品組以待測(cè)樣品液代替標(biāo)準(zhǔn)肝素 溶液進(jìn)行測(cè)定。 取加有標(biāo)準(zhǔn)肝素溶液和試劑的各管，測(cè)定其在 300nm 波長(zhǎng)處吸收值每下降 0.04單位所需時(shí)間（ t1），以及未含肝素組（對(duì)照）所需時(shí)間（ t），以 t1/ t為 Y 軸，肝素含 量為 X 軸，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而得到回歸方程（標(biāo)準(zhǔn)曲線使用的檢測(cè)范圍在 4U 活性以下）。根據(jù)待測(cè)樣品在相同條件下測(cè)得的所需時(shí)間（ t 測(cè) ），可求出肝素的量。 第三章 免疫分析法 一、學(xué)習(xí)要點(diǎn) 1、掌握抗體、抗原的概念特性及應(yīng)用 2、掌握免疫分析法的概念與方法 3、掌握放射免疫分析法、熒光免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法、克隆酶給予體免疫分析法、免疫擴(kuò)散法的基本原理、操作過(guò)程和應(yīng)用 4、熟悉免疫分析技術(shù)的實(shí)際操作步驟和在實(shí)踐中的應(yīng)用 5、熟 悉半抗原和載體的選擇原則 二、名詞 1、免疫分析法：以特異性抗原 -抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法 2、抗原：指能在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)。 3、全抗原：同時(shí)具有免疫原性和抗原特異性的物質(zhì)。 4、半抗原：只能與特異抗體作用但不能引起機(jī)體免疫應(yīng)答的簡(jiǎn)單物質(zhì)。 5、抗體：是機(jī)體經(jīng)抗原刺激由免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生的一組免疫球蛋白，通常由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成。 6、免疫原：是人工將抗原制成能刺激機(jī)體引起體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)的物質(zhì)。 7、單克隆抗體：建立在經(jīng)細(xì)胞融合而獲得的雜交瘤細(xì)胞基礎(chǔ)上的，針對(duì)某一特殊抗 原決定簇的抗體。 8、效價(jià)：又稱滴度，指某一物質(zhì)與一定容量的另一物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)所需要的量 9、 免疫擴(kuò)散法：根據(jù)抗原和抗體在瓊脂介質(zhì)中擴(kuò)散的結(jié)果，對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行分析的一種方法。這里瓊脂介質(zhì)是指瓊脂凝膠 ，絕大多數(shù)的抗原抗體的相對(duì)分子量都在 20 萬(wàn)以下，能夠在瓊脂凝膠中自由擴(kuò)散，其擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)服從氣體自由擴(kuò)散定律，在擴(kuò)散過(guò)程中，凝膠中形成擴(kuò)散物的濃度梯度，在抗原 /抗體最適比例處，形成肉眼可見(jiàn)的免疫沉淀；由于不同抗原物質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)不同，擴(kuò)散速度就不同，這樣就可以達(dá)到分離的目的。 10、克隆酶給予體免疫分析（ CEDIA）：是利用 重組 DNA 技術(shù)，合成B-galactosidase 的兩個(gè)獨(dú)立存在時(shí)無(wú)酶活性的蛋白質(zhì)片段，但兩者結(jié)合時(shí)則顯示出酶活性的原理。 三、應(yīng)掌握的知識(shí)點(diǎn) 1、通常物質(zhì)的抗原性指免疫原性和抗原特異性。 2、大多藥物分子，相對(duì)分子量較小，通常被認(rèn)為是半抗原。 3、半抗原的選擇：半抗原結(jié)構(gòu)中最好含有芳香結(jié)構(gòu)，選擇半抗原時(shí)應(yīng)考慮抗原-抗體反應(yīng)的微環(huán)境，合理地利用分子類似物間的交叉反應(yīng)。 4、合成抗原通常以蛋白質(zhì)為載體。 5、合成抗原的測(cè)定：定性測(cè)定方法包括光譜分析和熱分析；定量測(cè)定方法包括相對(duì)含量測(cè)定和絕對(duì)含量測(cè)定。 6、抗 體具有高度特異性，在免疫分析中 IgG 是最常用的抗體。 7、免疫分析中，常用到的兩類抗體為抗血清和單克隆抗體。抗血清由抗原直接免疫動(dòng)物得到，而單克隆抗體需將預(yù)先免疫過(guò)的小鼠細(xì)胞與體外培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，再篩選而得。 8、抗血清的制備分為以下幾個(gè)步驟：免疫原的制備，動(dòng)物免疫、放血、抗血清分離及抗血清分析鑒定。 9、常用的免疫原有水劑、福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑。 10、免疫分析中用于制備抗血清的動(dòng)物通常為家兔和羊，而家兔是首選的免疫動(dòng)物。 11、通常利用合成抗原制備兔抗半抗原免疫血清 時(shí)常采用常量免疫法。 12、效價(jià)測(cè)定方法有雙向免疫擴(kuò)散法、單向免疫擴(kuò)散法、對(duì)流電泳法、被動(dòng)血凝法和 ELISA 法。 13、對(duì)提純單克隆抗體的含量測(cè)定方法通常采用紫外吸收法。 14、均相免疫分析方法是基于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合原理來(lái)測(cè)定體液中藥物濃度。 15、氯胺 T 法式目前最成熟采用最多的放射性標(biāo)記法，主要用于對(duì)蛋白質(zhì)、多肽激素和含碘氨基酸的標(biāo)記。 16、分離結(jié)合或游離的放射性物質(zhì)常用以下幾種方法：柱層析法和電泳法、吸附法、沉淀法、抗抗體法、微孔濾膜法、固相法。 17、用紫外光照射蛋白質(zhì)，可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生熒光，色氨酸是產(chǎn)生熒 光的主要成分。 18、經(jīng)典的酶聯(lián)免疫分析法實(shí)驗(yàn)步驟可概括為包被、洗滌、與特異性抗體反應(yīng)、與酶聯(lián)抗抗體反應(yīng)、顯色和測(cè)定。 19、 ELISA 實(shí)驗(yàn)技術(shù)主要包括直接法和夾心法兩種。 20、 ELISA 使用的微孔板通常為聚苯乙烯板，它和蛋白類抗原有較強(qiáng)的相互作用。 21、半抗原通常以半抗原 -載體結(jié)合物的形式包被。 22、免疫擴(kuò)散包括單向簡(jiǎn)單擴(kuò)散、簡(jiǎn)單輻射擴(kuò)散、單向雙擴(kuò)散和兩向雙擴(kuò)散。 23、 四、重點(diǎn)與難點(diǎn) 1、 免疫分析法的應(yīng)用主要集中在以下幾個(gè)方面：（ 1）在實(shí)驗(yàn)藥物動(dòng)力學(xué)和臨床藥物學(xué)中測(cè)定生物利用度和藥物代謝動(dòng)力學(xué)參 數(shù)等生物藥劑學(xué)中的重要數(shù)據(jù)，以便了解藥物在體內(nèi)的吸收、分解、代謝和排泄的情況；（ 2）在藥物的臨床檢測(cè)中，對(duì)治療指數(shù)小、超過(guò)安全劑量易發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)或最佳治療濃度和毒性反應(yīng)濃度有交叉的藥物的血藥濃度進(jìn)行檢測(cè)； (3)在藥物生產(chǎn)中從發(fā)酵液或細(xì)胞培養(yǎng)液中快速測(cè)定有效成分的含量，以實(shí)現(xiàn)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程的在線監(jiān)測(cè)（ 4）對(duì)藥品中是否存在特定的數(shù)量有害雜質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。 2、 免疫分析法的定義及種類 免疫分析法是以特異性抗原 -抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法。 基于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合原理的均相免疫分析法有以下幾種：（ 1）放射免疫分析法 RIA，是最早建 立的經(jīng)典免疫分析法，反射免疫分析中常用的標(biāo)記物采用最多的是 125I標(biāo)記物和氚標(biāo)記物。分離結(jié)合或游離的放射性物質(zhì)進(jìn)而進(jìn)行測(cè)定是放射免疫分析的關(guān)鍵。（ 2）熒光免疫分析法 FIA：包括熒光淬滅法，熒光增強(qiáng)法，熒光偏振法，時(shí)間分辨熒光免疫分析法等。（ 3）克隆酶給予體免疫分析法：是利用重組 DNA 技術(shù)，合成 B-galactosidase 的兩個(gè)獨(dú)立存在時(shí)無(wú)酶活性的蛋白質(zhì)片段，但兩者結(jié)合時(shí)則顯示出酶活性的原理。 液 -固免疫分析體系：利用各種理化方法，實(shí)現(xiàn)抗原或抗體與不溶性介質(zhì)如聚苯乙烯微孔板、各類凝膠載體、膜的連接，并利用高 靈敏的檢測(cè)手段來(lái)測(cè)定抗原 -抗體反應(yīng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體或抗原的分析。主要有酶聯(lián)免疫分析法。 3 3、抗體的效價(jià)及測(cè)定方法 與一定的抗原能發(fā)生反應(yīng)的抗體的最大稀釋度。 常用的測(cè)定方法包括免疫擴(kuò)散法、間接血凝法和 ELISA。 4、酶聯(lián)免疫分析法的基本原理和方法步驟 基本原理： ELISA 是一種固相免疫測(cè)定技術(shù)，它先將抗體或抗原包被到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)，將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，后加入酶標(biāo)抗體與免疫復(fù)合物結(jié)合，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離的未結(jié) 合成分，最后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其吸光度（ A）值的發(fā)小進(jìn)行定性或定量分析的方法。 （ 1）雙抗體夾心法：首先，將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體；其次，加受檢標(biāo)本，形成固相抗原復(fù)合物；再次，加酶標(biāo)抗體，使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合；最后，加底物，根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。 （ 2）間接法：首先，將特異性抗原與固相載體連接形成固相抗原；其次，加稀釋的受檢血清；再次，加酶標(biāo)抗抗體；最后加底物顯色。 （ 3）競(jìng)爭(zhēng)法：首先，用已知特異性抗體寶貝固相載體；其次測(cè) 定管加待測(cè)抗原和一定量的酶標(biāo)抗原，經(jīng)過(guò)溫育，使二者與固相抗體結(jié)合，對(duì)照管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體 直 接結(jié)合；最后加底物顯色。 5、蛇毒的酶聯(lián)免疫測(cè)定法 蛇毒是從各種毒蛇蛇頭毒腺 (相當(dāng)于唾液腺 )中分泌的一類物質(zhì)，其成分比較復(fù)雜，蛋白質(zhì)約占干重的 90%，約含 20 30 種蛋白質(zhì)組分，其中包括 5 15 種酶、3 12 種非酶活性蛋白質(zhì)或多肽，例如神經(jīng)毒素、膜活性肽、舒緩激肽增強(qiáng)肽、肌肉毒素、出血因子等。利用酶聯(lián)免疫測(cè)定法測(cè)定蛇毒的方法步驟如下。 （ 1）方法：雙抗夾體心型 ELISA，聚苯乙烯微量反應(yīng)板法。 （ 2）原 理：固相的抗蛇毒抗體和蛇毒、酶標(biāo)記的抗蛇毒抗體依次反應(yīng)形成結(jié)合物，最后使底物顯色。 （ 3）材料： 蛇毒精制品 兔抗蛇毒血清 堿性磷酸酯酶 戊二醛 0.05mol/LNa2CO3-NaHCO3(pH9.6)緩沖液 0.01mol/LPBS-0.05%吐溫 20（ pH7.4）（ PBS-吐溫） 底物緩沖液（ pH9.8）： 0.05mol/L；碳酸鹽緩沖液內(nèi)含 10-3mol/LMgCl2、1mg/mL4-硝基酚磷酸鹽 待測(cè)血清標(biāo)本、正常人血清 （ 4）操作步驟 按戊二醛一 步法制得堿性磷酸酯酶和兔抗蛇毒抗血清的結(jié)合物 兔抗蛇毒抗血清用 0.05mol/L 碳酸鹽緩沖液（ pH9.6）以 1:300 稀釋，在聚苯乙烯微量反應(yīng) 板的每個(gè)孔內(nèi)加入 0.3mL。 37 孵育 5h 后。用 PBS-吐溫洗滌三次，每次 3min。 蛇毒精制品用健康人血清以 1 1000ng/mL 濃度分別稀釋后，再用 PBS-吐溫以 1:200 稀釋；待測(cè)的血清同樣用 PBS-吐溫以 1： 200 稀釋。 已包被的孔內(nèi)加入上述樣品或血清標(biāo)本 0.3mL， 4 過(guò)夜后同上洗滌。 酶結(jié)合物用 PBS-吐溫以 1:100 稀釋，每孔內(nèi)加入 0.3mL， 37 孵育 3h 后，同上洗滌。 每孔內(nèi)加入底物溶液 0.3mL，室溫下靜止 30min 后用 3mol/LNaOH 溶液 50L終止反應(yīng)。 判定結(jié)果可用目測(cè)法或分 光光度計(jì)測(cè)定吸光度值（ A400nm）。 根據(jù)蛇毒 精制品的測(cè)定結(jié)果可繪制成劑量 -反應(yīng)曲線，對(duì)待測(cè)血清中的蛇毒加以定量。 6、載體的選擇原則 （ 1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)考慮載體對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的影響。在免疫過(guò)程中，合成抗原免疫動(dòng)物，不僅可以產(chǎn)生抗半抗原抗體，也會(huì)產(chǎn)生大量的抗載體蛋白抗體。因此選擇載體蛋白是應(yīng)考慮載體對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的影響。這通常包括兩方面 ：其一為選擇的載體應(yīng)和檢驗(yàn)體系不發(fā)生交叉反應(yīng)。 其二，為在進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ ELISA）等免疫分析時(shí)，常將包被合成 抗原用作競(jìng)爭(zhēng)抗原或作為陽(yáng)性對(duì)照，此時(shí)用于包被的合成抗原的載體應(yīng)和用于免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體的合成抗原的載體蛋白不同。（ 2）免疫過(guò)程中應(yīng)考慮載體相應(yīng)的影響。在人工抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中，抗體的特異性依賴于半抗原分子結(jié)構(gòu)中的免疫決定區(qū)，但整個(gè)載體蛋白大分子對(duì)于抗體反應(yīng)的性質(zhì)和量也有影響。常見(jiàn)的載體有牛血清百蛋白（），卵清蛋白（），破傷風(fēng)類毒素（）和鑰孔蛋白（ KLH）。 第四章 電泳分析法 一、學(xué)習(xí)要點(diǎn) 1、掌握電泳分析的概念及基本原理 2、掌握各類重要電泳分析技術(shù)的基本操作 3、掌握影響電泳分離的因素 4、了解電泳的分類和發(fā)展 二、名詞 1、電泳法：是指帶電荷的供試品在惰性支持介質(zhì)中，在電場(chǎng)的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量的方法。 2、電滲現(xiàn)象：液體在電場(chǎng)中，對(duì)于固體支持介質(zhì)的相對(duì)移動(dòng) 。 3、免疫電泳技術(shù)：將瓊脂電泳與免疫擴(kuò)散結(jié)合起來(lái)，也就是說(shuō)利用電場(chǎng)作用下帶電蛋白質(zhì)在瓊脂凝膠中具有不同的遷移率，以及相同的蛋白質(zhì)具有完整的抗原性的特點(diǎn)，用于分析抗原或抗體性質(zhì)的一種技術(shù)。 三、應(yīng)掌握的知識(shí)點(diǎn) 1、電泳法可分為三類： 自由界面電泳、區(qū)帶電泳、高效毛細(xì)管電泳。其中區(qū)帶電泳是目前應(yīng)用最廣泛的電泳技術(shù)。 2、影響遷移率的主要因素有：帶電顆粒的性質(zhì)；電場(chǎng)強(qiáng)度；緩沖液的性質(zhì)；電滲作用；溶液的溫度和黏度；分子篩效應(yīng)。 3、電泳按支持介質(zhì)不同可分為紙電泳，醋酸纖維素薄膜電泳，瓊脂糖凝膠電泳；，聚丙烯酰胺凝膠電泳， SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。 4、毛細(xì)管電泳 CE 也稱高效毛細(xì)管電泳 HPCE，是近十幾年迅速發(fā)展起來(lái)的一種新的分離方法。 5、免疫電泳包括簡(jiǎn)單免疫電泳、對(duì)流免疫電泳、“火箭”免疫電泳和雙向免疫電泳。 四、重點(diǎn)與難點(diǎn) 1、電泳分析 法的基本原理 不同帶電顆粒，因其所帶電荷性質(zhì)和多少以及形狀和大小等差異，使其在同一電場(chǎng)強(qiáng)度、相同的支持介質(zhì)和緩沖液的條件下，各自的泳動(dòng)速度不同，從而使各種帶電顆粒如蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子得以分離。 2、影響遷移率的因素 帶電顆粒的性質(zhì)包括大小、形狀及所帶電荷量；緩沖液的性質(zhì)包括 pH 值和離子強(qiáng)度；電場(chǎng)強(qiáng)度，保持穩(wěn)定的電場(chǎng)強(qiáng)度是電泳成敗的重要條件；溶液的溫度和黏度；電滲作用；分子篩效應(yīng)。 3、電泳分析法的分類 （ 1）按支持介質(zhì)不同可分為紙電泳，醋酸纖維素薄膜電泳，瓊脂糖凝膠電泳；，聚丙烯酰胺凝膠電泳， SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。 （ 2）按用途不同可分為：分析電泳，制備電泳，定量免疫電泳，連續(xù)制備電泳。 4、 HPCE 較 HPLC 的優(yōu)點(diǎn) （ 1） HPCE 較 HPLC 分析時(shí)間短； （ 2） HPCE 較 HPLC 柱效高很多； （ 3） HPCE 較 HPLC 流動(dòng)相用量少很多； （ 4） HPCE 可做微量制備。 二者都是高效的分離技術(shù)，也都有多種分離模式，儀器操作均可自動(dòng)化。但是 HPCE分離速度更快，使用樣品量更少（ pg 量級(jí)）效率更高，可分離的范圍更廣（從離子到大分子化合物），但是維持費(fèi)用則更低。因此具有更明顯的優(yōu)勢(shì)。但是， HPCE目前只能實(shí)現(xiàn)微量制備，不能取代 HPLC。 5、瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)肝素鈉的鑒別 肝素鈉是從豬或牛的腸粘膜中提取的硫酸氨基葡萄糖的鈉鹽，屬黏多糖類物質(zhì)，具有延長(zhǎng)血凝時(shí)間的作用。利用電泳法可以對(duì)肝素鈉進(jìn)行鑒別。 （ 1）溶液的制備及制膠 醋酸 -鋰鹽緩沖液（ pH3.0）。取冰醋酸 50mL，加水 800mL 混勻后，用氫氧化鋰調(diào)節(jié) pH 值至 3.0，再加水至 1000mL。 苯甲胺藍(lán)溶液。取苯甲胺藍(lán) 0.1g，加水 100mL 使溶解。 制膠。取瓊脂糖約 0.2g，加水 10mL，置水浴鍋中加熱使溶脹完全，加溫?zé)岬拇姿?-鋰鹽緩沖液（ pH3.0） 10mL，混勻，趁熱將膠液涂布與大小適宜（ 2.5cm 7.5cm或 4cm 9cm）的玻板上，厚度約 3mm，靜置，待凝膠結(jié)成無(wú)氣泡的均勻薄層，即得。 （ 2）供試品和對(duì)照品溶液的制備：取本品與肝素標(biāo)準(zhǔn)品，分別加水制成每 1mL中含 2.5mg 的溶液即得 （ 3）電泳：在電泳槽內(nèi)加入醋酸 -鋰鹽緩沖液（ pH3.0），將凝膠板置于電泳槽架上，經(jīng)濾紙橋浸入緩沖液。于凝膠板負(fù)極端分別點(diǎn)樣 1mL，立即接通電源，在電壓梯度約 30V/cm、電流強(qiáng)度 1 2mA/cm 的條件下，電泳約 20min，立即關(guān)閉電源。取下凝膠板，用甲苯胺藍(lán)溶液染色，用水洗去多余的染色液至背景無(wú)色為止。 （ 4）結(jié)果判斷：供試品和標(biāo)準(zhǔn)品所顯斑點(diǎn)的遷移距離之比應(yīng)為 0.9 1.1。 第五章 高效液相色譜法 一、學(xué)習(xí)要點(diǎn) 1、掌握 HPLC 的基本理論 2、掌握 HPLC 的常用定性方法和定量方法及其優(yōu)缺點(diǎn) 3、熟悉 HPLC 的基本組成部件和工作流程 4、熟悉 HPLC 的固定相、流動(dòng)相及其選擇 5、了解 HPLC 的發(fā)展過(guò)程和 HPLC 的優(yōu)點(diǎn)及適用范圍 6、了解 HPLC 的分類 7、了解 HPLC 的應(yīng)用 二、名詞 1、液相色譜法：以液體為流動(dòng)相的色譜法。 2、經(jīng)典液相色譜法：用常壓輸送流動(dòng)相的方法，這種色譜法的柱效能低、分離周期長(zhǎng)。 3、高效液相色譜法（ HPLC）：是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，用高壓輸送流動(dòng)相，又稱高壓液 相色譜法或者高速液相色譜法。 4、色譜圖：色譜儀以電信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間做圖所繪制的曲線。 5、峰高：色譜峰頂?shù)交€的垂直距離。 6、峰寬：峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所做的兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。 7、峰面積：峰和峰底所包圍的面積。峰面積或峰高是定量分析的主要依據(jù)。 8、保留時(shí)間：樣品通過(guò)色譜柱所需的時(shí)間，即從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后出現(xiàn)組分濃度極大值所需的時(shí)間。 9、保留體積：從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后被測(cè)組分出現(xiàn)濃度最大值時(shí)流出溶劑的總體積。 10、分離度：表示相鄰兩峰的分離程度。 三、應(yīng)掌握的知識(shí)點(diǎn) 1、 HPLC 具有分離效能高、選 擇性高、檢測(cè)靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。 2、高效液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。 4 3、根據(jù)分離機(jī)制不同， HPLC 可分為化學(xué)鍵合色譜法、液 -固吸附色譜法、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法、空間排阻色譜法，液 -液分配色譜，親和色譜等。 4、 HPLC 利用純物質(zhì)對(duì)照法來(lái)進(jìn)行定性。常用的定量方法有內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法、主要成分自身對(duì)照法、面積歸一化法等。 5、 HPLC 廣泛應(yīng)用于生物藥物的鑒別、檢查和含量測(cè)定。 6、色譜柱參數(shù)主要有：相平衡參數(shù)，柱選擇參數(shù)和柱效參數(shù)（包括理論塔板數(shù)和理論塔板 高） 7、要獲得較好的色譜分離有兩個(gè)途徑，一是最大峰間的距離要大，二是色譜峰要窄。 8、通常用理論塔板數(shù)來(lái)定量地表示色譜柱的分離效率（簡(jiǎn)稱柱效）。如果峰形對(duì)稱并符合高斯分布，理論塔板數(shù)可用峰寬和保留時(shí)間來(lái)表示： 22 16 wtRtRn 為標(biāo)準(zhǔn)偏差； w 為峰寬。 也可用半高峰寬（ Wh/2）和保留時(shí)間的關(guān)系來(lái)表示： 22/54.5 hWtRn9、理論塔板數(shù)與柱長(zhǎng)成正比，柱子越長(zhǎng)， n 值越高。用 n 表示理論塔板數(shù)時(shí)應(yīng)注明柱長(zhǎng)，如果未注明，則表示柱長(zhǎng)為 1m 時(shí)的理 論塔板數(shù)。 10、分離度越長(zhǎng)，色譜峰分離越好，但并非要求其值很大，二是爭(zhēng)取在最短的時(shí)間內(nèi)獲得最佳分離效果。如果得到的是高斯曲線，分離度 R=1.5（ 6 的峰間距離）對(duì)于定量分析就足夠了。 11、高效液相色譜法可以用于定性分析藥物，比如用于藥物的鑒別和檢查，也可以用于定量分析藥物。 12、高效液相建立實(shí)驗(yàn)方法的時(shí)候，首先需要考慮，樣品的性質(zhì)；色譜分離的類型；溶劑的選擇；檢測(cè)器的選擇。 13、溶劑的處理主要有溶劑的純化，溶劑的脫氣，緩沖液的防腐。 14、 HPLC 操作過(guò)程中經(jīng)常會(huì)遇到問(wèn)題，比如無(wú)柱后流出液或無(wú)柱壓， 可能由于溶劑的管路有滲漏；如果出現(xiàn)平頭峰，可能會(huì)是柱子過(guò)載或檢測(cè)器過(guò)載；如果柱壓過(guò)高，有可能樣品或溶劑組分有殘留；檢測(cè)器具有低背景噪音，可能參比池臟了或有其外來(lái)物等等。 四、重點(diǎn)與難點(diǎn) 1、 HPLC 的定義及特點(diǎn) HPLC 是一種以高壓輸出的液體為流動(dòng)相的色譜技術(shù)。具有分離效能高、選擇性高、檢測(cè)靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。 2、常用的化學(xué)鍵合相的種類及在液相色譜法中的應(yīng)用 常用的化學(xué)鍵合相有十八烷基硅烷，辛烷基，氨基及氰基等。 化學(xué)鍵合相廣泛應(yīng)用于正相與反相色譜法，離子交換色譜法，手性色譜法及親和色譜法等。 3、 HPLC 對(duì)流動(dòng)相的要求 流動(dòng)相一般采用分析純?cè)噭?，必要時(shí)進(jìn)一步純化；避免使用引起柱效損失或保留特性變化的溶劑；對(duì)試樣要有適宜的溶解度；溶劑的粘度要?。灰着c檢測(cè)器相匹配。 4、正相色譜與反相色譜的定義及適用分離的組分 最早， 液 -液色譜有正相和反相之分 ，目前已被正相鍵合色譜法和反相鍵合色譜法所代替， 如果采用極性固定相和相對(duì)非極性流動(dòng)相，就稱為正相；如果采用相對(duì)非極性固定相和極性流動(dòng)相，則稱為反相。 所以正相色譜一般可用于分離極性化合物 ， 反相色譜一般可用于分離非極性或弱極性化合物。 5、高效液相色譜儀的組成及主 要部件 組成主要為高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。 主要部件包括儲(chǔ)液罐，攪拌超聲脫氣器，梯度淋洗裝置，高壓輸液泵，流動(dòng)相流量顯示，柱前壓力表，輸液泵泵頭，過(guò)濾器，阻尼器，六通進(jìn)樣閥，保護(hù)柱，色譜柱，檢測(cè)器，記錄儀，回收廢液罐。 6、利用反相高效液相色譜法測(cè)定生長(zhǎng)抑素的含量 （ 1）色譜條件：色譜柱規(guī)格為 Ominispher C18 柱（ 250mm 46mm， 5m，美國(guó)Varian 公司）。流動(dòng)相 A 液： 含 0.1%三氟乙酸的水溶液；流動(dòng)相 B 液：含 0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；采用梯度洗脫，洗脫程序：流動(dòng)相 A 與流動(dòng)相 B 比列在 2min維持 100:0，然后， 20min 內(nèi)由 100:0 調(diào)至 65:35，流速 1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng) 215nm，注溫為室溫；進(jìn)樣量 20L。理論塔板數(shù)按生長(zhǎng)抑素峰計(jì)算大于 20000，樣品色譜圖如圖（ a）所示。 （ 2）樣品含量測(cè)定：精密稱取合成的生長(zhǎng)抑素原料約為 10mg，置 50mL 量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得貯備液。再吸取 4mL 置 10mL 量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，取 20L 進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。 第六章 生物檢定法 一、學(xué)習(xí)要點(diǎn) 1、掌握生物檢定法的概念、特點(diǎn) 2、掌握效價(jià)檢定的基本概念，生物檢定的常用方法 3、掌握抗生素的微生物檢定法 4、熟悉對(duì)比檢定的原理與計(jì)算 5、了解實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析 6、了解生物檢定的應(yīng)用范圍 二、名詞 1、生物檢定法：利用藥物對(duì)生物體（整體動(dòng)物、離體組織、微生物等）的作用以測(cè)定其效價(jià)或生物活性的一種方法。 2、質(zhì)反應(yīng)：當(dāng)一定劑量的藥物注入動(dòng)物體內(nèi)后，觀察某一反應(yīng)或反映的某一特定程度出現(xiàn)與否，只有出現(xiàn)與不出現(xiàn)兩種情況，故不能用量來(lái)表示個(gè)體的反 應(yīng)程度，只能用一組動(dòng)物中出現(xiàn)正或負(fù)反應(yīng)的百分率來(lái)表示，這類反應(yīng)成為質(zhì)反應(yīng)。 3、量反應(yīng)：藥物對(duì)生物體所引起的反應(yīng)隨著藥物劑量的增加產(chǎn)生的量變。 4、瓊脂擴(kuò)散法：也稱管碟法，是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，采用量反應(yīng)平行線原理的設(shè)計(jì)，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法。 5、抗生素微生物檢定法：利用抗生素在低微濃度下選擇性地抑制或殺死微生物的特點(diǎn)，以抗生素的抗菌活性為指標(biāo)，來(lái)衡量抗生素中的有效成分效力的方法。 三、應(yīng)掌握的知識(shí)點(diǎn) 1、生物檢定的應(yīng)用范圍主要用 于藥物的效價(jià)測(cè)定、微量生理活性物質(zhì)的測(cè)定、中藥質(zhì)量的控制、某些有害雜質(zhì)的限度檢查等。 2、生物反應(yīng)基本上可分為質(zhì)反應(yīng)和量反應(yīng)，質(zhì)反應(yīng)是特殊的量反應(yīng)。 3、生物檢定統(tǒng)計(jì)方法包括質(zhì)反應(yīng)的直接測(cè)定法和量反應(yīng)的平行線測(cè)定法。 4、微生物檢定法測(cè)定抗生素效價(jià)一般可分為稀釋法、濁度法和瓊脂擴(kuò)散法三類。其中濁度發(fā)和瓊脂擴(kuò)散法被列為抗生素微生物檢定的國(guó)際通用方法。我國(guó)一直將管碟法作為微生物檢定的經(jīng)典方法。 5、生物反應(yīng)是生物檢定的基礎(chǔ)，被測(cè)物特有的生物學(xué)作用都可作為生物法分析的基礎(chǔ)。 6、由于抗生素多為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多組分物質(zhì) ，異構(gòu)體多，且不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生降解雜質(zhì)，故各國(guó)藥典均以微生物檢定法為主要含量測(cè)定法。 7、生物制品的效力，從實(shí)驗(yàn)室檢定來(lái)講，一是指制品中的有效成分的含量水平，二是指制品在機(jī)體中建立自動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫后所引起的抗感染作用的能力。 四、重點(diǎn)與難點(diǎn) 1、生物檢定法的定義與常用的生物檢定方法 生物檢定法是利用藥物對(duì)生物體（整體動(dòng)物、離體組織、微生物等）的作用以測(cè)定其效價(jià)或生物活性的一種方法。 常用的生物檢定法有：胰島素生物檢定法，肝素生物檢定法，抗生素的微生物檢定法。 2、微生物檢定法測(cè)定抗生素常用方法及原理 方法 主要有稀釋法、比濁法和擴(kuò)散法，其中擴(kuò)散法中的管碟法應(yīng)用最為廣泛。 （ 1）稀釋法是將等量的試驗(yàn)菌菌液加入到含有不同濃度抗生素的液體培養(yǎng)基中，觀察液體培養(yǎng)基中有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，多得的結(jié)果是一種范圍而不是絕對(duì)值。 （ 2）比濁法是將一定量的抗生素加入至培養(yǎng)基中，混勻后，短期培養(yǎng)，培養(yǎng)基變渾濁，通過(guò)測(cè)定其透光率可知道細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。 （ 3）管碟法式利用抗生素在攤布特定試驗(yàn)菌的固體培養(yǎng)基內(nèi)呈球面形擴(kuò)散，形成含一定濃度抗生素球形區(qū)，抑制了試驗(yàn)菌的繁殖而呈現(xiàn)出透明的抑菌圈。 3、管碟法測(cè)定抗生素效價(jià)的影響因素 實(shí)驗(yàn)菌種， 培養(yǎng)基，雙碟的制備，雙碟的培養(yǎng)溫度和時(shí)間，抗生素污染，標(biāo)準(zhǔn)品。 4、生物檢定法在生物藥物分析中的應(yīng)用 生物檢定主要用于藥物的效價(jià)測(cè)定、微量生理活性物質(zhì)的測(cè)定、中藥質(zhì)量的控制、某些有害雜質(zhì)的限度檢查等。 5、生物制品的效力檢定方法可分為： （ 1） 動(dòng)物保護(hù)力試驗(yàn) （ 2）活菌數(shù)和活病毒滴度測(cè)定 （ 3）類毒素和抗毒素的單位測(cè)定 （ 4）血清學(xué)試驗(yàn) （ 5）其他相關(guān)效力的檢定與評(píng)價(jià) 6、生物檢定效價(jià)測(cè)定中劑量與反應(yīng)的關(guān)系 生物檢定是利用藥物不同劑量引起生物體反應(yīng)程度的變化進(jìn)行藥物效價(jià)測(cè)定的，要計(jì)算效價(jià)，首先要 研究劑量與反應(yīng)之間的關(guān)系。 在生物鑒定中，劑量與反應(yīng)中一般都是曲線關(guān)系，可通過(guò)各種坐標(biāo)轉(zhuǎn)換的方法，使劑量與反應(yīng)間呈直線關(guān)系。最便于處理和應(yīng)用。 生物反應(yīng)基本上可分為以下兩種類型，即 質(zhì)反應(yīng)和量反應(yīng)。 （ 1）質(zhì)反應(yīng)，當(dāng)一定劑量的藥物注入動(dòng)物體內(nèi)后，觀察某一反應(yīng)或反應(yīng)的某一特定程度出現(xiàn)與否，例如死或不死，驚厥或不驚厥，只有出現(xiàn)與不出現(xiàn)兩種情況，故不能用量來(lái)表示個(gè)體的反應(yīng)程度，只能用一組動(dòng)物中出現(xiàn)正（或負(fù)）反應(yīng)的百分率來(lái)表示，如死亡率、驚厥率，這類反應(yīng)稱質(zhì)反應(yīng)。 在質(zhì)反應(yīng)中，將動(dòng)物分組，分別給以不同劑量，通過(guò)調(diào)節(jié)劑 量，是最大劑量組接近但不全部產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，最小劑量組接近但不全部產(chǎn)生陰性反應(yīng)，則各組陽(yáng)性反應(yīng)動(dòng)物的百分率將隨劑量的增加而遞升，劑量與反應(yīng)率之間的關(guān)系是一條長(zhǎng)尾的“肩斜”形曲線，如將劑量轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)，反應(yīng)率轉(zhuǎn)換為適當(dāng)?shù)暮瘮?shù)后則呈直線關(guān)系，常見(jiàn)的轉(zhuǎn)換方法有概率單位 等。 （ 2）量反應(yīng)，藥物對(duì)生物體所引起的反應(yīng)隨著藥物劑量的增加產(chǎn)生的量變可以測(cè)量者稱為量反應(yīng)。例如血壓的變化值，血糖濃度，組織器官重量的增減，抑菌圈直徑的大小等。時(shí)反應(yīng)雖有某些特殊性，但基本上仍屬于量反應(yīng)，它是觀察某一反應(yīng)或反應(yīng)的某種程度出現(xiàn)所需的時(shí)間， 例如血液的凝結(jié)時(shí)間、動(dòng)物生存的時(shí)間等。 在一定劑量范圍內(nèi)，很多量反應(yīng)中反應(yīng)與劑量的關(guān)系是一種先銳后鈍 的類似對(duì)數(shù)曲線，此時(shí)將劑量轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)劑量，即可成一條直線，屬于這一類的有抗生素效價(jià)測(cè)定中藥濃度與抑菌圈的直徑、催產(chǎn)素與大鼠離體子宮的收縮高度等。 但大部分時(shí)反應(yīng)中，劑量與反應(yīng)呈現(xiàn)先銳的曲線，將劑量轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)，反應(yīng)值亦可以轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)，則二者呈直線關(guān)系，屬于這一類型的有肝素濃度與體外血凝時(shí)間，凝血因子 VIII 與體外促凝時(shí)間。 通常利用對(duì)數(shù)進(jìn)行坐標(biāo)轉(zhuǎn)換已能解決大部分曲線的直線化問(wèn)題，其他方法還有將 5 反應(yīng)值轉(zhuǎn)為平方根， 立方根或倒數(shù)等。 第七章 生物藥物的雜質(zhì)與安全性檢查 一、學(xué)習(xí)要點(diǎn) 1、掌握一般雜質(zhì)檢查的原理、方法、計(jì)算，特殊雜質(zhì)檢查方法的類型、特點(diǎn)以及藥物安全性檢查的項(xiàng)目和方法。 2、掌握生物安全性檢查的主要方法 3、熟悉雜質(zhì)檢查方法以及一般雜質(zhì)檢查和特殊雜質(zhì)檢查方法的區(qū)別 4、了解雜質(zhì)的概念、來(lái)源、分類及限量的制定 二、名詞 1、雜質(zhì)：任何影響藥物純度的物質(zhì)均稱為雜質(zhì)。 2、一般雜質(zhì)：指在自然界分布較廣泛，在多種藥物的生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中容易引入的雜質(zhì)，如酸、堿、水分、氯化物、硫酸鹽、砷鹽、重金屬等。 3、特殊雜質(zhì) ：指在個(gè)別藥物的生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中引入的雜質(zhì)。 4、信號(hào)雜質(zhì)：指非毒性雜質(zhì) ,由于具有和供試品類似的結(jié)構(gòu)或官能團(tuán)，而在檢測(cè)時(shí)也具有同樣的信號(hào)，干擾供試品的檢測(cè)的物質(zhì) 。 5、雜質(zhì)限量：指藥物中所含雜質(zhì)的最大允許量。 6、重金屬：指在實(shí)驗(yàn)條件下能與顯色劑作用顯色的金屬雜質(zhì)，一般包括銀、鉛、汞、銅、鎘、鉍、砷、銻、錫、鋅、鈷、鎳等。 7、灼熾殘?jiān)核幬铮ǘ酁橛袡C(jī)藥物）經(jīng)高溫加熱分解或揮發(fā)后殘留下的不揮發(fā)物質(zhì)（多數(shù)為金屬氧化物、氯化物、碳酸鹽、磷酸鹽、硅酸鹽）。 8、干燥失重：指藥物在規(guī)定條件下，經(jīng)干燥后，所減少的重量 ，主要指水分，也包括其他揮發(fā)性物質(zhì)如乙醇等。 9、熱原：是指在藥品中能夠引起人及動(dòng)物的體溫異常升高的致熱性物質(zhì)，目前一般認(rèn)為熱原反應(yīng)主要是由于細(xì)菌內(nèi)毒素引起的。 三、應(yīng)掌握的知識(shí)點(diǎn) 1、雜質(zhì)檢查是控制藥物雜質(zhì)，確保安全、有效用藥，保證藥品質(zhì)量的重要措施。 2、藥物中的雜質(zhì)是藥物純度的一個(gè)重要方面，所以藥物的雜質(zhì)檢查又叫純度檢查。 3、雜質(zhì)會(huì)由下列各種情況引入藥品中： （ 1）在合成藥物生產(chǎn)過(guò)程中，未反應(yīng)完全的原料、反應(yīng)的中間體和副產(chǎn)物，在精制時(shí)未能完全除去，就會(huì)成為產(chǎn)品中的雜質(zhì)。 （ 2）從動(dòng)植物原料中提取 分離藥物時(shí)，由于原料中常常含有與藥物結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相近的物質(zhì)，在提取過(guò)程中，分離不完全，便可能引入產(chǎn)品中。如由哺乳動(dòng)物睪丸中提取得到的玻璃酸梅，是一種能水解玻璃粘多糖的酶，若提取不周，易把睪丸中的另一組分酪氨酸引入。 （ 3）在藥物的生產(chǎn)過(guò)程中，還常加入試劑、溶劑等，如不能完全除去，也會(huì)使產(chǎn)品中存在有關(guān)雜質(zhì)。如使用酸性或堿性試