諾尼發(fā)酵果汁對糖尿病老鼠的降糖保肝活性(西沙諾麗酵素).doc

護(hù)肝活性 諾尼的保健功效國際最新研究進(jìn)展論文集Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, 2011, ID: 875293.海巴戟天（諾尼）發(fā)酵果汁對糖尿病老鼠的降糖護(hù)肝活性海巴戟天（諾尼）發(fā)酵果汁對糖尿病老鼠的降糖護(hù)肝活性B. Shivananda Nayak, Julien R.Marshall, Godwin Isitor, and Andrew Adogwa(西印度大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)系，圣奧古斯丁大街，特立尼達(dá)和多巴哥)摘要：海巴戟天是一種用于治療糖尿病和肝臟疾病的藥用植物。海巴戟天發(fā)酵果汁（光學(xué)密度= 1.25）被用來研究糖尿病大鼠的降糖特性和保肝。大鼠隨機(jī)分成4組（對照組，糖尿病實(shí)驗(yàn)組，糖尿病標(biāo)準(zhǔn)組和糖尿病未治療組）各6只。糖尿病鼠通過注射鏈脲佐菌素（50mgkg體重）誘發(fā)。糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和糖尿病標(biāo)準(zhǔn)組分別口服海巴戟天發(fā)酵果汁和降糖藥格列本脲20天。對空腹血糖，體重，肝組織糖原組分，以及肝惡化程度進(jìn)行了評(píng)估結(jié)果表明：相比糖尿病未治療組（FBS=360.0mg/dl15.81），兩組血糖水平均顯著降低（分別為150毫克/分升15.88和125毫克/分升3.89），（P 0。003）；在實(shí)驗(yàn)第十天，糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物表現(xiàn)出體重下降（10.2克，5.11%），在第二十天又顯著增加（6克，3%，P 0。022）；肝組織組織學(xué)研究表明，與其他三組相比，未經(jīng)處理的糖尿病動(dòng)物出現(xiàn)明顯的脂肪變性。本研究的數(shù)據(jù)表明海巴戟天具有降糖保肝活性。引言 糖尿病（DM）是一種代謝紊亂疾病，其特征是高血糖，伴隨著由胰島素分泌或胰島素作用缺失或兩者同時(shí)發(fā)生而引起的碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝紊亂。通過幾種激素可以調(diào)節(jié)參與脂肪碳水化合物和蛋白質(zhì)代謝的主要代謝途徑，這對身體機(jī)能至關(guān)重要。胰島素是一種胰激素，它對于碳水化合物，脂肪和蛋白質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)是必不可少的。它的功能是通過抑制分解代謝如脂肪分解、糖異生、蛋白水解與糖苷分解來保存身體能量和建立能量儲(chǔ)備。胰島素能促進(jìn)糖原、脂肪酸合成、腸道氨基酸的吸收和血糖吸收 1，2 。細(xì)胞胰島素生產(chǎn)不足或不敏感或兩者兼具均為糖尿病核心病因。糖尿病的控制主要有增加胰島素的分泌，增強(qiáng)分泌細(xì)胞對胰島素敏感性，并抑制腸道葡萄糖的吸收，減少胃排空。目前的治療方法，盡管十分有效，但可能有不良的副作用。此外，持續(xù)使用上面列出的藥物可能給用戶帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān) 3 。使用藥用植物的自然療法被認(rèn)為是高血糖和肝毒性的有效和安全替代治療方法。由于具有臨床效果好，副作用小，而且成本相對較低的特點(diǎn)，中草藥越來越引起人們的興趣。中草藥或它們的提取物在其生物活性化合物未知的情況下已被廣泛應(yīng)用4。因此，對植物提取物的研究有助于了解其療效和作用機(jī)制及安全性。在特立尼達(dá)和多巴哥，多種植物由于在治療糖尿病上具有顯著效果，被當(dāng)代傳統(tǒng)治療師作為藥物使用。這些包括苦瓜(Caraaili)，木瓜(Paw-paw)，長春花(white periwinkle)，Neurolaena lobata（zebapique），號(hào)角樹(trumpet Bush)，Cordia curassavica（Black Sage），和Bontia daphnoides（Olive Bush）。這些植物的使用者聲稱治療效果非常好，有的甚至可能超過現(xiàn)代藥物的臨床效果 5，6 。海巴戟天（茜草科）也被稱為諾尼，或印度桑樹，是一種小型的常青樹。它發(fā)源于太平洋群島，法屬波利尼西亞，亞洲和澳大利亞。樹葉長8英寸或更長，橢圓形。果直徑3到4英寸，帶疣狀麻面。海巴戟天是波利尼西亞人的一種最重要的傳統(tǒng)藥用植物，從關(guān)節(jié)炎和燒傷到糖尿病、癌癥、皮膚炎癥和創(chuàng)傷等方面均被大范圍的使用710 。1 方法1.1 發(fā)酵提取物的制備從當(dāng)?shù)毓?yīng)商收集剛收獲的成熟諾尼。使用微溫水沖洗水果以去除真菌和其他對熱敏感的微生物。將諾尼切成塊，放入2000mL的容器中，然后加入500mL的水。在室溫下發(fā)酵6-10周。在發(fā)酵后期，400mL的發(fā)酵液被轉(zhuǎn)移到一個(gè)1000mL的容器中。400mL發(fā)酵液采用whatman濾紙過濾，并通過真空過濾去除發(fā)酵液中的碎片和果粒。取30mL的過濾發(fā)酵液進(jìn)行定性化學(xué)分析，10mL用于紫外/可見光譜分析和光密度測定。剩下的360mL用于本實(shí)驗(yàn)。1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇體重在200到220克之間的健康SD雄性大鼠用于本研究。動(dòng)物被單獨(dú)安置并提供正常的食物和自由飲用水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前后定期量體重。使用血糖儀，采用葡萄糖氧化酶、過氧化物酶反應(yīng)評(píng)估動(dòng)物的空腹血糖水平。從大鼠尾巴靜脈抽血用于葡萄糖評(píng)估。所有老鼠的任何感染都受到密切觀察，那些表現(xiàn)出感染癥狀者將被隔離并排除出研究。研究得到了圣奧古斯丁西部印度大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（EC-A/ 5-2009）。大鼠被隨機(jī)分成4組，每組各6只如下：（a）正常對照組：本組僅使用食品和水。（b）糖尿病實(shí)驗(yàn)組：除食品和水，這組還使用海巴戟天發(fā)酵果汁（在338 nm下，OD值= 1.2470）口服劑量2ml/kg，每日兩次，從糖尿病誘導(dǎo)產(chǎn)生開始服用20天。（c）糖尿病組標(biāo)準(zhǔn)：除了食品和水，該組接受溶解在DMSO中的格列本脲，口服20天，劑量為2毫克/公斤/天，補(bǔ)充和替代醫(yī)學(xué)證據(jù)。（d）糖尿病未治療組：這組大鼠僅提供食物和水。各組均提供食物和水自由采食。1.3 糖尿病誘導(dǎo)通過給腹腔隔夜禁食的成年SD大鼠注射50毫克/公斤的鏈脲佐菌素（溶于pH值4.5的冷檸檬酸緩沖液）以誘發(fā)糖尿病。三天之后，老鼠空腹血糖200毫克的被認(rèn)為有糖尿病。1.4 組織學(xué)研究20天后，取出各組中的老鼠肝臟用于組織學(xué)研究。組織固定于10%緩沖鹽水中用于常規(guī)組織學(xué)評(píng)價(jià)。從組織中切下7微米切片，其中一些用碘酸希夫（PAS）染色，其它用蘇木精和曙紅染色。1.5 統(tǒng)計(jì)分析在不同的時(shí)間間隔測量不同組的空腹血糖和體重值，采用單因素方差進(jìn)行分析，通過比較描述性測試，然后采用Dunnetts post hoc檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)用SPSS分析（Version 16.0，芝加哥，美國）。組間差異在P0.5時(shí)被認(rèn)為是顯著的。2 結(jié)果2.1 植物化學(xué)分析 海巴戟天發(fā)酵果汁的植物化學(xué)成分定性分析中發(fā)現(xiàn)存在皂甙、三萜類、黃酮類化合物、類固醇和強(qiáng)心苷類物質(zhì)。2.2 空腹血糖經(jīng)過二十天的治療，與未經(jīng)治療的糖尿病動(dòng)物相比，海巴戟天治療的糖尿病動(dòng)物和降糖藥物格列本脲治療的糖尿病標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物的空腹血糖明顯恢復(fù)正常。在實(shí)驗(yàn)糖尿病動(dòng)物中，空腹葡萄糖過剩量顯著減少，葡萄糖量從300毫克/分升（3天）下降到150毫克/分升（20天），減少了52.6%。糖尿病標(biāo)準(zhǔn)組空腹血糖從250毫克/分升降至125毫克/分升。在未處理的糖尿病動(dòng)物中未觀察到空腹血糖水平的降低（圖2）。2.3 體重變化 在接下來的10天治療后，糖尿病實(shí)驗(yàn)組和標(biāo)準(zhǔn)組大鼠的體重明顯增加分別增加3和8個(gè)百分點(diǎn)。而在20天的治療期間，未經(jīng)治療的糖尿病大鼠的體重下降（16.3克，8.17%）（圖1）（P 0.022）。糖尿病大鼠的體重變化正常糖尿病+諾尼糖尿病+標(biāo)準(zhǔn)糖尿病未治療DI = 糖尿病誘導(dǎo)PDI =糖尿病后起始TS = 開始治療PTI =開始治療后起始 圖1：從基礎(chǔ)水平（治療前）到藥物治療20天間測定的正常對照，糖尿病實(shí)驗(yàn)，糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)，與糖尿病未治療老鼠的體重（N =6）每一列代表的意思是SE。（P 0.022）與糖尿病未治療為對照（單因素方差分析，描述試驗(yàn)，Dunnetts multiple comparison post hoc檢驗(yàn)）。海巴戟天對糖尿病大鼠空腹血糖的影響正常糖尿病+諾尼糖尿病+標(biāo)準(zhǔn)糖尿病未治療DI = 糖尿病誘導(dǎo)PDI =糖尿病后起始TS = 開始治療PTI =開始治療后起始 圖2：從基礎(chǔ)水平（治療前）到藥物治療20天間測定的正常對照，糖尿病實(shí)驗(yàn)，糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)，與糖尿病未治療老鼠的空腹血糖（N =6）每一列代表的意思是SE。（P 0.003）與糖尿病未治療為對照（單因素方差分析，描述試驗(yàn)，Dunnetts multiple comparison post hoc檢驗(yàn)）。2.4 組織學(xué)分析相比于從正常對照肝組織（圖3）和糖尿病實(shí)驗(yàn)組肝組織（圖4），未經(jīng)處理的大鼠肝臟組織學(xué)分析結(jié)果顯示有明顯的脂肪變性（圖5）。與正常對照（圖3）、糖尿病實(shí)驗(yàn)組（圖4）以及糖尿病標(biāo)準(zhǔn)組（圖6）相比，未經(jīng)處理的糖尿病大鼠35%的肝細(xì)胞形狀不規(guī)則，在肝細(xì)胞質(zhì)中可看到大量脂肪浸潤（圖5）。圖3：正?？刂拼笫蟾闻K標(biāo)本的組織學(xué)圖片（PAS染色）。肝臟標(biāo)本上無脂肪浸潤。整個(gè)滑坡區(qū)糖原顆粒分布均勻。圖4：海巴戟天治療大鼠肝臟標(biāo)本的組織學(xué)圖片（PAS染色）。肝臟標(biāo)本上又很少的小脂肪浸潤。整個(gè)滑坡區(qū)糖原顆粒分布均勻。圖5：未治療的糖尿病大鼠肝臟標(biāo)本的組織學(xué)圖片（PAS染色）。肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)有許多大的脂肪細(xì)胞。糖原沉積稀疏而不規(guī)則。脂肪粒的存在使肝細(xì)胞的形態(tài)也改變了。圖5：糖尿病標(biāo)準(zhǔn)大鼠肝臟標(biāo)本的組織學(xué)圖片（PAS染色）。觀察到組織完好的糖原顆粒。4 討論空腹血糖是糖尿病大鼠的一個(gè)重要糖尿病狀態(tài)指示器。本研究結(jié)果清楚地表明，海巴戟天的效果與參考口服降糖藥格列本脲等效。事實(shí)上，都能顯著降低高血糖。諾尼汁成分可能像sulphonylurias或gliptines一樣通過像促進(jìn)胰島素分泌，或如雙胍類和格列酮類藥物一樣通過增加胰島素受體敏感性來降低血糖水平。最近，科學(xué)家研究表明Argania刺和狗牙根提取也有類似降糖現(xiàn)象 11，12 。諾尼發(fā)酵果汁治療動(dòng)物，在治療的最后10天表現(xiàn)出體重的增加（3%）。相反，同時(shí)未經(jīng)治療的糖尿病動(dòng)物表現(xiàn)出（8.17%）體重的下降。與諾尼汁治療組的大鼠相比，未經(jīng)治療的糖尿病動(dòng)物消耗了更多的水。與未治療糖尿病大鼠相比，采用諾尼汁治療后肝細(xì)胞脂肪變性減少了（脂肪粒小且少），這表明發(fā)酵諾尼汁具有肝保護(hù)作用。Wang et al. 的研究證明的諾尼汁對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用13。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)印度蜂蜜保護(hù)肝臟免受乙酰氨基酚引起的肝損傷，可以作為一種有效的保肝藥 14 。肝臟保護(hù)活性與其抗氧化性質(zhì)相關(guān)。分析我們的結(jié)果和以前的報(bào)告，我們推測，海巴戟天具有保肝活性是因?yàn)槠浜芯哂锌寡趸钚缘狞S酮類成分。諾尼汁的降血糖活性，是由于三萜類化合物和皂甙的存在。研究人員證明海巴戟天含有大量的活性成分如黃酮類化合物，三萜類化合物，三萜皂甙等15，16。研究表明，皂甙可明顯抑制胃排空17，18。皂甙可像peptides-1（GLP-1）一樣促進(jìn)胰高血糖素分泌或抑制胰高血糖素降解阻止胃排空。這種藥通過引起的胃輕癱減緩養(yǎng)分吸收進(jìn)入血液，是一種控制血糖的有效方法。同時(shí)，海巴戟天中的皂苷可以通過對胰高血糖素降解的影響和提高葡萄糖的利用率來降低血糖。另據(jù)報(bào)道，皂素刺激胰島素從胰腺中釋放 19 （圖7），它可以像肽一樣降低胰高血糖素的降解率。另一方面，格列本脲通過刺激胰島素分泌和抑制胰高血糖素的釋放來發(fā)揮降血糖的作用。剩余的完整的胰腺細(xì)胞受到海巴戟天或格列本脲的刺激，血清胰島素水平升高，而血糖下降。蘆丁是一種黃酮苷糖組分（一種蕓香糖和槲皮素化合物）在諾尼中被大量發(fā)現(xiàn)，據(jù)推測，這種蕓香糖殘基可能作為促分泌素，借助一種蔗糖相關(guān)的機(jī)制促進(jìn)胰島素的分泌。三萜類化合物也被認(rèn)為可能是一類有利于糖尿病的控制的治療劑，因?yàn)樗麄円驯蛔C明能有效的改善小鼠的癥狀性糖尿和降血糖 20，21 。以上是初步證據(jù)，尚需要進(jìn)一步的詳細(xì)研究，以找出海巴戟天果汁中是否存在一個(gè)或多個(gè)上述機(jī)制。因此，海巴戟天發(fā)酵果汁似乎在控制血糖和肝損傷方面是有效的。通過純化諾尼汁和活性成分的鑒定可能會(huì)產(chǎn)生一個(gè)良好的降糖和保肝藥物。降低血糖分泌胰島素胰腺諾尼果汁黃酮（蘆?。┰碥誘riterprenoids減少胃排空減少營養(yǎng)物質(zhì)吸收進(jìn)入血液降低血糖圖7 示意圖說明諾尼果汁成分可能有降低血糖的作用。5 結(jié)論這項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)表明，海巴戟天發(fā)酵果汁可能具有降血糖和保肝作用。海巴戟天能在二十天內(nèi)顯著改