綜合性實(shí)驗(yàn)植物體內(nèi)過(guò)氧化物酶活性測(cè)定及同工酶電泳.ppt

綜合性實(shí)驗(yàn)植物體內(nèi)過(guò)氧化物酶活性測(cè)定及同工酶電泳 過(guò)氧化物酶活性測(cè)定一 原理1 過(guò)氧化物酶 peroxidase POD 廣泛存在于各種動(dòng)物 植物和微生物體內(nèi) 催化由過(guò)氧化氫參與的各種還原劑的氧化反應(yīng) RH2 H2O2 2H2O R2 POD分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn) POD是一種由單一肽鏈與卟啉構(gòu)成的血紅素蛋白 脫輔基蛋白分子須與血紅素結(jié)合才構(gòu)成全酶 3 POD的主要生理功能 參與活性氧代謝過(guò)程 參與木質(zhì)素和木栓質(zhì)的合成 參與生長(zhǎng)素的降解 二 實(shí)驗(yàn)材料與試劑1 材料 玉米幼苗2 試劑 0 1mol L磷酸緩沖液 pH6 0 0 1mol L磷酸緩沖液 pH7 0 愈創(chuàng)木酚 H2O2三 實(shí)驗(yàn)步驟1 提取酶液 取樣品1 0g 加入2ml的0 05mol LpH5 5的磷酸緩沖液 冰浴研磨 10000rpm 4 離心后取上清 即為粗酶液 2 酶活性測(cè)定 采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定 對(duì)照為煮沸5分鐘的粗酶液 反應(yīng)體系包括 0 05mol LpH5 5的磷酸緩沖液2 9ml 0 05mol L愈創(chuàng)木酚1ml 2 H2021ml 粗酶液0 1ml 反應(yīng)1分鐘后 立刻在470nm下 測(cè)定OD值 以每分鐘在470nm處吸光度的變化0 01為一個(gè)酶活單位 3 計(jì)算酶活性 選取OD值變化較均勻的一段數(shù)據(jù) 代入公式計(jì)算 以每分鐘OD值變化0 01作為1個(gè)過(guò)氧化物酶活力單位 U 酶活力 活力單位 U w gFW 注 W W總 gFW V ml V總 POD活性 U g min 注 A470為反時(shí)間內(nèi)吸光度的變化 w為樣品質(zhì)量t為反應(yīng)時(shí)間Vt為提取酶液總體積Vs為測(cè)定時(shí)間酶液體積 A470 Vt W Vs 0 01 t 同工酶電泳一 原理聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑作用下聚合而成 具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 其網(wǎng)孔大小可由凝膠濃度和交聯(lián)度加以調(diào)節(jié) 凝膠電泳兼有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng) 被分離物質(zhì)由于所載電荷數(shù)量 分子大小和形狀的差異 因此在電泳時(shí)產(chǎn)生不同的泳動(dòng)速率而相互分離 利用特異性的顏色反應(yīng)使待測(cè)酶著色 這樣就可在凝膠中展現(xiàn)出酶譜 過(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)常見(jiàn)的氧化酶 植物體內(nèi)許多生理代謝過(guò)程常與它的活性及其同工酶的種類有關(guān) 利用過(guò)氧化物酶能催化H2O2把聯(lián)苯胺氧化成藍(lán)色或棕褐色產(chǎn)物的原理 將經(jīng)過(guò)電泳后的凝膠置于有H2O2及聯(lián)苯胺的溶液染色 出現(xiàn)藍(lán)色或棕褐色部位即為過(guò)氧化物酶同工酶在凝膠中存在的位置 多條有色帶即構(gòu)成過(guò)氧化物酶同工酶譜 本實(shí)驗(yàn)利用垂直板凝膠電泳 采用Tris Gly緩沖系統(tǒng)來(lái)分離陰離子過(guò)氧化物酶同工酶 二 材料 儀器設(shè)備及試劑1 材料 玉米幼苗2 儀器設(shè)備 穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀 冷凍離心機(jī)及離心管 pH試紙 3 試劑 1 分離膠緩沖液 pH8 9 1mol LHCl48ml Tris36 6g TEMED0 23ml 加水定容至100ml 2 分離膠貯液 30g丙烯酰胺 0 8g甲叉雙丙烯酰胺 加水溶解并定容至100ml 過(guò)濾后使用 3 過(guò)硫酸銨溶液 過(guò)硫酸銨0 2g 加水定容至100ml制膠時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用 4 濃縮膠緩沖液 1mol LHCl48ml Tris5 98g TEMED0 46ml 調(diào)pH6 7 并定容至100ml 5 濃縮膠貯備液 丙烯酰胺10g 甲叉雙丙烯酰胺2 5g 加水定容到100ml 使用前過(guò)濾 6 電極緩沖液 Tris6 0g Gly28 8g 用水定容至1000ml pH8 3 用前稀釋10倍 7 四甲基乙二胺 TEMED 8 0 1 的溴酚藍(lán)水溶液 9 聯(lián)苯胺染色母液 聯(lián)苯胺1g 冰醋酸18ml H2O2ml溶解貯于棕色瓶中 三 實(shí)驗(yàn)步驟1 安裝電泳槽2 凝膠的配制3 過(guò)氧化物酶的提取 稱取1g待測(cè)植物鮮樣置于冰浴上的研缽內(nèi) 加入1mlH2O或0 05mol LTris HCl緩沖液 pH6 8 研成勻漿 轉(zhuǎn)入離心管 再用2ml前述溶液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部轉(zhuǎn)入離心管 3500rpm離心15 20min 上清液即為酶提取液 供電泳分析用 4 點(diǎn)樣 取10ul樣品加等體積的40 的蔗糖溶液和5ul2 的溴酚藍(lán)5 電泳6 剝膠 電泳完畢 將電泳槽取出 倒去緩沖液 取下凝膠管 放入培養(yǎng)皿中 用一個(gè)帶有長(zhǎng)針頭的注射器 吸滿水 將針頭沿管壁插入 同時(shí)慢慢地將注射器中的水推出 并不斷轉(zhuǎn)動(dòng)凝膠管 將凝膠管擠脫出來(lái) 也可用洗耳球擠壓 7 染