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成都醫(yī)學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文 本本 科科 畢畢 業(yè)業(yè) 論論 文文 題題 目 目 聚蛋白多糖基因多態(tài)性與骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)性研究聚蛋白多糖基因多態(tài)性與骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)性研究 姓姓 名 名 學(xué)學(xué) 號 號 06254000590625400059 院院 系 系 檢驗醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院 年年 級 級 20062006 級級 專專 業(yè) 業(yè) 醫(yī)學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)檢驗 指導(dǎo)教師 指導(dǎo)教師 孫鹥主治醫(yī)師孫鹥主治醫(yī)師 實習(xí)單位 實習(xí)單位 云南省第一人民醫(yī)院云南省第一人民醫(yī)院 二二 一二一二 年年 五五 月月 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文 目 錄 中文摘要 I 英文摘要 II 前 言 1 1 材料與方法 1 1 1 研究對象 1 1 2 排除對象 1 1 3 主要試劑和儀器 1 1 4 方法 1 1 4 1 DNA 提取 1 1 4 2 PCR 擴增 2 1 4 3 電泳 2 1 5 統(tǒng)計學(xué)處理 2 2 結(jié)果 2 2 1 可變長度重復(fù)序列數(shù)目確定 2 2 2 PCR 產(chǎn)物電泳 2 2 3 聚蛋白多糖基因多態(tài)性分布 3 3 討論 4 結(jié) 論 5 參考文獻 5 致 謝 6 誠信聲明 6 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文 I 聚蛋白多糖基因多態(tài)性與骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)性研究 摘 要 目的 目的 探索骨性關(guān)節(jié)炎與聚蛋白多糖基因多態(tài)性的相關(guān)性 方法 方法 單關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者 80 例 同時設(shè)健康對照組 30 例 應(yīng)用 PCR 技術(shù)擴增兩組基因組 DNA 中的聚蛋白多糖基因 以瓊脂糖 凝膠電泳測 PCR 產(chǎn)物的基因條帶 觀察其多態(tài)性 結(jié)果結(jié)果 正常人的重復(fù)序列數(shù)目以 28 29 為主 骨 性關(guān)節(jié)炎組以 26 27 28 頻率為主 其它重復(fù)序列數(shù)目無比較意義 結(jié)論結(jié)論 聚蛋白多糖基因中的重 復(fù)序列數(shù)目 26 27 28 的頻率比較中骨性關(guān)節(jié)炎組高于正常組 由于標本量的限制 相關(guān)性仍需 進一步研究 關(guān)鍵詞 骨性關(guān)節(jié)炎 聚蛋白多糖基因 多態(tài)性 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文 II Correlation Study between Aggrecan Gene Polymorphism and Osteoarthritis Abstract Objective To explore the association between osteoarthritis and aggrecan gene polymorphism Methods The study group consisted of 80 patients with single knee osteoarthritis and 30 healthy controls Genomic DNA can be obtained from blood of all people and then aggrecan gene can be amplified by PCR The PCR products can be analyzed by agarose gel electrophoresis Results The significant repeat number in osteoarthritis are 26 27 and 28 while healthy control are 28 and 29 Conclulsion Compared with healthy control the frequency of repeat number 26 27 and 28 are high However based on the currently available data there are unclear correlation between aggrecan gene polymorphism and osteoarthritis So further study should be needed Key words osteoarthritis aggrecan gene polymorphism 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文 1 前 言 骨性關(guān)節(jié)炎 osteoarthritis OA 是最常見的關(guān)節(jié)疾病之一 困擾著全世界約2億多患者 OA的主要病理特點是軟骨細胞外基質(zhì)的降解超過合成 軟骨降解的原因很多 但引起該過程的最主 要原因是蛋白水解酶活性的增高 其中聚蛋白多糖酶和基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP 是與軟骨退行性變關(guān) 系最密切的兩個家族 MMP曾被認為是降解軟骨聚蛋白多糖和膠原的主要酶類 但有研究顯示聚蛋白 多糖酶在這一變化中發(fā)揮主要作用 而且在骨性關(guān)節(jié)炎早期可能是唯一降解聚蛋白多糖的酶類 聚 蛋白多糖酶是一種蛋白水解酶 是解整鏈蛋白金屬蛋白酶 ADAMTS 家族的成員 它可以調(diào)節(jié)軟骨細 胞外基質(zhì) 使其發(fā)揮維持關(guān)節(jié)軟骨正常生物化學(xué)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用 ADAMTS 家族的許多成員在 體外的聚蛋白多糖降解活動中占有一定的數(shù)量 包括ADAMTS 1 4 5 8 9 和15 1 4 其中 ADAMTS 1 和ADAMTS 8 也具有聚蛋白多糖酶活性 在軟骨中也可見到它們的表達 但是由于 ADAMTS 1 和ADAMTS 8 的作用比較弱 因此被公認的聚蛋白多糖酶只有兩個 ADAMTS 4 和ADAMTS 5 個體代謝的差異取決于代謝酶的重要基因位點 DNA 序列不同 這些基因多態(tài)性可以影響酶的表 達水平 結(jié)構(gòu) 催化能力等方面 骨關(guān)節(jié)炎中最早出現(xiàn)的改變是關(guān)節(jié)軟骨的損傷 其病理表現(xiàn)是軟 骨細胞外基質(zhì)含量減少和軟骨細胞死亡 其中 聚蛋白多糖丟失是關(guān)節(jié)炎的主要病理表現(xiàn)之一 在 聚蛋白多糖的降解中聚蛋白多糖酶在這一病理變化中發(fā)揮主要作用 聚蛋白多糖酶活性和疾病關(guān)系 的研究已開展較多 本實驗從聚蛋白多糖酶裂解位點片段的的基因也就是聚蛋白多糖基因的多態(tài)性 入手 研究聚蛋白多糖基因與骨性關(guān)節(jié)炎疾病的相關(guān)性 對患者和正常人的聚蛋白多糖基因多態(tài)性 進行測定比較 結(jié)果報告如下 1 材料與方法 1 1 研究對象 選自 2010 年 1 月到 2011 年 2 月云南省第一人民醫(yī)院骨科 因膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹行 MRI 檢查的患者 80 例 其中男性 37 例 女性 43 例 25 到 57 歲 平均 37 6 歲 診斷符合中華醫(yī) 學(xué)會骨科學(xué)分會 2007 年頒布的骨關(guān)節(jié)炎診斷指南中 OA 的診斷標準 同時設(shè) 30 例健康對照組 1 2 排除對象 有炎癥 創(chuàng)傷及手術(shù)史 腫瘤 糖尿病等疾病的患者 診斷或者疑似為風(fēng)濕 類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎等自身免疫性疾病的患者 檢查前兩周內(nèi)使用過糖皮質(zhì)類固醇激素 非甾體消炎止痛藥的患 者 妊娠 哺乳期間的婦女 有感染性關(guān)節(jié)炎 其他反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)疾病的患者 重度 OA 需行關(guān)節(jié)置換的患者 年齡超過57 歲 1 3 主要試劑和儀器 提取DNA的試劑為購自百泰克生物的全血基因組DNA快速提取試劑盒 批號 20050321 PCR試 劑 瓊脂糖凝膠電泳的Marker購自寶生物工程 大連 有限公司 DNA擴增設(shè)備為SLAN熒光定量PCR 儀 PCR引物委托上海生工合成 1 4 方法 1 4 1 DNA 提取 空腹抽取靜脈血2ml于EDTA抗凝管中 顛倒混勻 用百泰克生物全血基因組DNA快速提取試劑盒 提取外周血DNA 具體方法為 取200 l血液放入1 5ml離心管 加入200 l結(jié)合液CB 輕搖混 勻 再加入20 l蛋白酶K溶液 輕搖混勻后70 放置10分鐘 加入100 l異丙醇輕搖混勻 此時 可能會出現(xiàn)絮狀沉淀 將上一步所得溶液加入一個吸附柱AC中 加入500 l去除液 IR 12000rpm離心30秒 棄掉廢液 加入700 l漂洗液WB 12000rpm離心30秒 棄掉廢液 加 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文 2 入500 l漂洗液WB 12000rpm離心30秒 棄掉廢液 將吸附柱AC放回空收集管中 13000rpm2分 鐘 盡量除去漂洗液 取出吸附柱AC 放入一個干凈的離心管中 在吸附膜的中間部位加100 l 洗脫緩沖液EB 室溫放置3 5分鐘 12000rpm離心1分鐘 將得到的溶液重新加入離心吸附柱中 室 溫放置2分鐘 12000rpm離心1分鐘 20 保存待測 1 4 2 PCR 擴增 參照文獻 5 設(shè)計的引物序列為上游引物5 TAGAGGGCTCTGCCTCTGGAGTTG 3 下游引物5 AGGTCCCCTACCGCAGAGGTAGAA 3 PCR反應(yīng)體系為25 l 包括DNA模板2 l Ex Tag DNA聚合酶 0 5 l Ex Tag Buffer 2 5 l dNTP mix 10mM 2 5 l P1 50pmol l P2 50pmol l 各0 2 l dH2O 17 4 l PCR反應(yīng)條件為94 變性1min 66 退火30sec 68 延伸2min 共30個 循環(huán) 最后在72 延伸5min 得到擴增產(chǎn)物 1 4 3 電泳 將所得的擴增產(chǎn)物在1 5 瓊脂糖凝膠上進行電泳 電泳條件為90V電泳100min 將得到的電泳結(jié) 果放在紫外光下觀測其條帶 并進行拍照記錄 1 5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 2檢驗對所得到的數(shù)據(jù)進行處理 分析骨性關(guān)節(jié)炎組與正常對照組的聚蛋白多糖基因多 態(tài)性分布有無差異 P 0 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義 2 結(jié)果 2 1 可變長度重復(fù)序列數(shù)目確定 聚蛋白多糖核心蛋白基因的外顯子 12 上串聯(lián)重復(fù)序列表現(xiàn)出重復(fù)數(shù)目的多態(tài)性 可變長度重復(fù) 序列 VNTR 聚蛋白多糖基因 PCR 產(chǎn)物大小與重復(fù)序列數(shù)目的關(guān)系 6 見表 2 1 根據(jù)出現(xiàn)核苷酸重 復(fù)序列的次數(shù)來劃分共有 13 種等位基因 表 2 1 PCR 產(chǎn)物與對應(yīng)的重復(fù)序列數(shù)目關(guān)系 PCR 產(chǎn)物大小 bp 重復(fù)序列數(shù)目 77513 106018 111719 117420 123121 128822 145925 151626 157327 163028 168729 185832 191533 2 2 PCR 產(chǎn)物電泳 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2 1 由圖2 1可見 大部分患者和正常對照組的PCR產(chǎn)物的分子量都在 1500bp至2000bp之間 對照表1 1 根據(jù)不同分子量的大小可以得到不同的等位基因 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文 3 圖 2 1 OA 組與正常組電泳比較 泳道 1 為 Marker 帶 分子量標準如圖所示 泳道 2 的等位基因是 28 26 泳道 3 的等位基因是 29 27 泳道 4 的等位基因是 29 26 泳道 5 的等位基因是 28 27 泳道 6 的等位基因是 29 27 泳道 7 的等位基因是 29 26 泳道 8 的等位基因是 28 27 2 3 聚蛋白多糖基因多態(tài)性分布 OA組與正常對照組的等位基因多態(tài)性結(jié)果見圖2 2 在已得的6個重復(fù)序列數(shù)中 重復(fù)序列 26 27 28有統(tǒng)計學(xué)意義 聚蛋白多糖基因重復(fù)序列數(shù)26 27 28在OA中的表達高于正常組 正常 組以28 29為主 圖 2 2 OA 組與正常組重復(fù)序列數(shù)目頻率比較 橫坐標表示重復(fù)序列數(shù)目 縱坐標表示重復(fù)序列數(shù)目出現(xiàn)的頻數(shù)在 各自組中所占的百分數(shù) 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文 4 3 討論 骨性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性 破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病 骨性關(guān)節(jié)炎是一 種慢性關(guān)節(jié)疾病 它的主要改變是關(guān)節(jié)軟骨面的退行性變和繼發(fā)性的骨質(zhì)增生 主要表現(xiàn)是關(guān)節(jié)疼 痛和活動不靈活 X 線表現(xiàn)關(guān)節(jié)間隙變窄 軟骨下骨質(zhì)致密 骨小梁斷裂 有硬化和囊性變 關(guān)節(jié) 邊緣有唇樣增生 后期骨端變形 關(guān)節(jié)面凹凸不平 關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨剝落 骨質(zhì)碎裂進入關(guān)節(jié) 形成關(guān) 節(jié)內(nèi)游離體 臨床用于治療骨性關(guān)節(jié)炎的藥物主要作用是緩解癥狀 控制炎癥與疼痛 卻不能保護 關(guān)節(jié)軟骨阻止病變的進展 病變最終可發(fā)展成為不可逆性的細胞外基質(zhì)的丟失和慢性殘疾 因此我 們需要從病因上尋找治療方法 骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展過程主要是由于關(guān)節(jié)軟骨的降解 軟骨的主要成分 是聚蛋白多糖 聚蛋白多糖基因影響著聚蛋白多糖的品質(zhì) 研究聚蛋白多糖基因有助于了解聚蛋白 多糖的降解 從而有助于分析發(fā)病的分子生物學(xué)基礎(chǔ) 為疾病的早期診斷 預(yù)防和治療提供幫助 聚蛋白多糖基因的個體差異是影響聚蛋白多糖品質(zhì)的重要因素 數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性 Variable Number of Tandem Repeats VNTR 又稱小衛(wèi)星 DNA Minisatellite DNA 是一種重復(fù) DNA 小序列 為 10 到幾百核苷酸 拷貝數(shù) 10 1000 不等 VNTR 多態(tài)性往往發(fā)生 在基因的非編碼序列 但是 1997 年 Doege 等 6 發(fā)現(xiàn)在聚蛋白多糖核心蛋白基因的外顯子 12 上 表現(xiàn)出 VNTR 多態(tài)性 而這一區(qū)域所編碼的正是核心蛋白的硫酸軟骨素結(jié)合位點 基因多態(tài)性的本 質(zhì)和序列的保守性有關(guān) VNTR 的多態(tài)性發(fā)生在高度保守區(qū)域 不同等位基因的表達可以引起個體 間聚蛋白多糖鏈長度的差異 從而導(dǎo)致聚蛋白多糖功能的差異 聚蛋白多糖的基因定位于15q26 7 其cDNA由7137個堿基對組成 成熟的聚蛋白多糖的核心蛋 白包括G1 G2 G3 三個折疊形式各不相同的球狀區(qū)域 G1和G2區(qū)域構(gòu)成核心蛋白的氨基端 G3區(qū) 域則位于核心蛋白的羧基端 G1區(qū)域包含兩個蛋白聚糖重復(fù)序列 proteogly can tandem repeat PTR 和一個免疫球蛋白序列 PTR構(gòu)成了透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)域 可非共價結(jié)合軟骨細胞外基 質(zhì) extracellular matrix ECM 中的透明質(zhì)酸 G2區(qū)域與G1區(qū)域結(jié)構(gòu)相似 G1和G2區(qū)域間的區(qū)域 稱為球間區(qū) 球間區(qū)的糖胺多糖結(jié)合位點上可以結(jié)合約100個硫酸軟骨素鏈和約30個硫酸角質(zhì)素鏈 G1和G2間的Glu 373 Ala 374 位點構(gòu)成了聚蛋白多糖酶的切割位點 而Ser 341 Phe 342 則 是MMP 3的切割位點 人工對聚蛋白多糖酶的切割位點進行突變 可以有效地抵抗該蛋白酶的切割 作用 G3區(qū)域的某些氨基酸序列分別和表皮生長因子 ECF C型凝集素 補體相關(guān)蛋白 CRP 有 同源性 G3區(qū)域 特別是其中的凝集素區(qū)域 對于聚蛋白多糖的細胞內(nèi)的合成階段起重要作用 它 引導(dǎo)核心蛋白初始鏈在各細胞器間順利定位和換位 先天性的G3區(qū)域缺失可導(dǎo)致致死性軟骨發(fā)育不 良 而在聚蛋白多糖被分泌入ECM后 G3對于聚蛋白多糖在細胞外基質(zhì)內(nèi)的繼續(xù)成熟和基質(zhì)中網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)的形成也有重要影響 目前對于 VNTR 等位基因頻率和 OA 的關(guān)系尚無定論 在以往對手關(guān)節(jié)炎的研究中發(fā)現(xiàn) 患者的 等位基因頻率和普通人群相似 以 27 28 為主 等位基因 27 和手關(guān)節(jié)炎相關(guān) 但是和膝關(guān)節(jié)炎卻 沒有相關(guān)性 8 Kirk 9 通過對 134 例患者進行了為期 50 年的研究證實 在所觀察到的 8 個等位基 因中 只有 25 26 27 28 具有統(tǒng)計學(xué)意義 并通過多因素方差分析比較等位基因 26 和 25 27 28 發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險 結(jié)果發(fā)現(xiàn) 等位基因 26 增加了風(fēng)險 在本研究得到的 7 個等位 基因中 等位基因 26 27 28 有統(tǒng)計學(xué)意義 聚蛋白多糖等位基因 26 27 28 在 OA 中的表達高 于正常組 提示等位基因 26 27 28 可能與骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)系較密切 可能的機制是 具有較短 VNTR 鏈等位基因的患者具有較少重復(fù)次數(shù)的聚蛋白多糖的側(cè)鏈相對較短 其涵養(yǎng)水分的能力也會 相應(yīng)減少 而其承載負荷的能力相對于正常聚蛋白多糖也較差 具有這種表型的個體在外因作用下 更容易發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨退行性變 但由于樣本量所限 其相關(guān)性仍需進一步研究 成都醫(yī)學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文 5 結(jié) 論 聚蛋白多糖基因中的重復(fù)序列數(shù)目 26 27 28 的頻率比較中 OA 組高于正常組 由于標本量 的限制 相關(guān)性仍需進一步研究 參考文獻 1 Collins Racie L A Flannery C R Zeng W et al ADAMTS 8 exhibits aggrecanase activity and is expressed inhuman articular cartilage J Matrix Biol 2004 23 4 219 230 2 Rodriguez Manzaneque J Westling J Thai S et al ADAMTS1 cleaves aggrecan at multiple sites and is differentially inhibited by metalloproteinase inhibitor J Biochem Biophys Res Commun 2002 293 1 501 508 3 Tortorella M D Liu R Q Burn T et al Characterization of human aggrecanase 2 ADAMTS 5 substrate specificity studies in comparison with aggrecanase 1 ADAMTS 4 J Matrix Biol 2002 21 6 499 511 4 Somerville R Longpre J Jungers K et al Characterization of ADAMTS 9 and ADAMTS 20 as a distinct ADAMTS subfamily related to Caenorhabditis elegans GON 1 J J Biol Chem 2003 278 11 9503 9513 5 P Roughley D Martens J Rantakokko The involvement of aggrecan polymorphism in degenration of human intervertebral disc and articular cartilage J European Cells and Materials 2006 11 1 7 6 Doege KJ Coulter SN Meek LM Maslen K Wood JG A human specific polymorphism in the coding region of the aggrecan gene J J Biol Chem 1997 272 21 13974 13979 7 Korenberg JR Chen XN Doege K Grover J Roughley PJ 1993 Assignment of the human aggrecan gene AGC1 to 15q26 u