免疫組化超詳細(xì)步驟

免疫組化一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模悍謩e用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗體檢測肺癌組織中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表達(dá)情況二 實(shí)驗(yàn)原理: 應(yīng)用免疫學(xué)基本原理抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù).三 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材:經(jīng)病理醫(yī)生確認(rèn)的肺癌組織切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗體、DAB顯色試劑盒、抗原修復(fù)液、PBS、蘇木素染料、1%鹽酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等四 實(shí)驗(yàn)設(shè)備：切片機(jī)、4冰箱、顯微鏡、烤片機(jī)五 主要試劑配置:緩沖液應(yīng)用液A NaH2PO4 38.4g配成1000毫升溶液應(yīng)用液B Na2HPO412H2O 114.8g配成1000毫升溶液配制1000毫升PBS需要14毫升應(yīng)用A液，36毫升應(yīng)用B液，加8.5gNaCl。枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液應(yīng)用液A 枸櫞酸 10.55g配成1000毫升溶液應(yīng)用液B 檸檬酸三鈉（三水合檸檬酸三鈉） 29.01g 配成1000毫升溶液配制500毫升抗原修復(fù)液需要9毫升應(yīng)用A液，41毫升應(yīng)用B液。蘇木素染液配方：蘇木素2g,無水乙醇250毫升，硫酸鋁17.6g蒸餾水750毫升，碘酸鈉0.2g，冰醋酸20毫升。先將蘇木素溶于無水乙醇，再將硫酸鋁溶于蒸餾水水中。兩液溶解后將其混合，加入碘酸鈉，最后加入冰醋酸。抗體說明書建議的抗體稀釋度N-Ras 1:50-1:500H-Ras 1:50-1:500K-Ras 1:20-1:200六 實(shí)驗(yàn)步驟：1組織常規(guī)石蠟切片厚度3-5um，防脫片撈片后晾干，放入72烤箱烤片2小時(shí)。2 切片脫蠟水化程序 二甲苯、脫蠟各12分鐘； 無水乙醇、各3分鐘；（洗二甲苯） 95%乙醇3分鐘； 85%乙醇3分鐘；3 自來水漂洗3分鐘，洗滌一定要充分。4 組織修復(fù)采用高溫高壓法：壓力鍋中加入pH 6.0 ，0.01M抗原修復(fù)液約1000ml，切片插入塑料架上，放入壓力鍋，蓋上鍋蓋（此時(shí)不扣上壓力閥）1600W預(yù)熱至沸騰，扣上壓力閥1300W，待高壓鍋閥門噴氣開始計(jì)時(shí)，修復(fù)時(shí)間為2分鐘。5 停止加熱并用流水沖洗高壓鍋以降溫，室溫冷卻。6將抗原修復(fù)后切片置自來水中，浸泡2分鐘。將樣本置于內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑3%H2O2，室溫放置4分鐘。（需要蓋蓋子）自來水洗2分鐘，PBS緩沖液洗滌2分鐘。7 取出切片，擦干組織周圍液體后滴加10%BSA封閉液，37孵育40分鐘。滴加一抗（濃度配比,PBS稀釋1:20、1:50、1:100、1:200）60ul，注意保持組織濕潤狀態(tài)但表面不能有液體，用試管使抗體全部覆蓋組織面且不能有氣泡，以使抗體能全部與組織接觸。8 滴加一抗后放入專用孵育盒內(nèi)，4冰箱過夜。9 切片放入PBS緩沖液中清洗3分鐘3次，充分洗滌，防止因洗滌不凈引起的非特異性染色。（前兩次的PBS倒掉）10擦干組織周圍液體后滴加70微升辣根酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物（根據(jù)實(shí)際情況要求覆蓋樣本），37溫箱內(nèi)孵育40分鐘。PBS緩沖液洗滌3分鐘3次.11 顯色，滴加現(xiàn)配適量DAB顯色劑（在1ml試劑2（DAB底物液）中，加入1滴（約50ul）試劑1（DAB濃縮液），混合液，即配成DAB工作液），配置DAB顯色劑的容器在冰凍切片機(jī)旁邊的冰箱里，其它試劑在入門口冰箱。室溫顯色,5-20分鐘。自來水終止顯色。第一遍的自來水需集中處理，自來水洗滌3分鐘。12 復(fù)染，蘇木素染液中染色40秒，水洗1分鐘。13 1%鹽酸酒精溶液分化3秒，流水漂洗。14 藍(lán)化10秒，流水漂洗。15 脫水，切片依次置于85%乙醇，95%乙醇各1分鐘，無水乙醇、中各2分鐘。16