免疫熒光檢測呼吸道病毒.doc

成人呼吸道感染病毒病原學(xué)檢測摘要: 目的 了解哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院成人呼吸道病毒感染的流行特征。方法 采用直接免疫熒光法（DIF），對2007年4月-2008年6月住院的399名16-87歲呼吸道疾病患者痰標(biāo)本進行七種病毒檢測。結(jié)果 399例患者中病毒檢測陽性者54例，病毒總體陽性率13.53。首位病毒為呼吸道合胞病毒29例（7.27）和流感病毒A型27例（6.77），其次為副流感病毒3型17例（4.26）、副流感病毒1型13例（3.26）、腺病毒5例（1.25）、流感病毒B型2例（0.50）和副流感病毒2型2例（0.50），混合感染22例（5.51）。64-87歲年齡組病毒檢出率最高（18.12），32-47歲年齡組病毒檢出率最低（6.94）。肺炎、支氣管炎、支氣管擴張、哮喘、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）均有病毒檢出，其中以COPD檢出率最高（16.67），其次是哮喘（15.38）。 結(jié)論 病毒在成人呼吸道感染中占有重要的地位，感染主要集中在48-87歲年齡階段（15.38），COPD和哮喘病毒感染率最高，以呼吸道合胞病毒和流感病毒A型最為常見。關(guān)鍵詞 呼吸道病毒感染；成人Abstract: Objective To understand the epidemiologic feature of respiratory tract viral infection in the adults of Harbin Medical University The Second Affiliated Hospital.Methods From April 2007 to June 2008, a total of 399 hospitalized adults were studied.Sputum were screened for virus by direct immunofluorescent (DIF) assay.Results Virus was identified in 54 patients ( 13.53%) .The most prevalent was respiratory syncytial viruses (RSV) (29, 7.27%) , followed by influenza A (27, 6.77%) , parainfluenza 3(17,4.26%) , parainfluenza 1(13,3.26%) , adenovirus (5, 1.25 %) ，influenza B (2, 0.50 %) , parainfluenza 2 (2, 0.50%) , and mixed viral infection(22, 5.51%).The highest virus detection rate (18.12%) occur in adults between 64 and 87 years, virus detection rate of the lowest (6.94%) exist in 37-47-year-old.Pneumonia, bronchitis, bronchiectasis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) have detected the virus, with the highest detection rate of COPD (16.67%), followed by asthma (15.38%).Conclusions Viruses still play an important role in respiratory tract infections in adults and was concentrated in the 48-87 age group(15.38%), the infection rate of COPD and asthma was the highest. Respiratory syncytial virus and influenza A virus was the most common types.Key words Respiratory tract viral infection;Adults材料和方法 1. 研究對象 2007年4月-2008年6月隨機選擇哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院呼吸科住院病人399例。其中年齡16歲-87歲，男性214例，女性185例。2. 設(shè)備及試劑 熒光顯微鏡（TS100），離心機（TGL20LM），漩渦混合器（XH-B），37培養(yǎng)箱（SKP-02.500），直接免疫熒光試劑盒（3137，chemicon）。3. 病毒抗原檢測3.1 標(biāo)本收集和處理 由專職護士將塑料導(dǎo)管經(jīng)鼻腔插入7-8cm達到咽部以下誘導(dǎo)吸取1-2ml分泌物于10ml無菌離心管中1，-40凍存。實驗時取出標(biāo)本，向離心管中加入4-8ml冷PBS,4放置3-4個小時，用漩渦混合器震蕩3-5分鐘后，標(biāo)本液轉(zhuǎn)移入1.5mlEP管中，1000-6000r/min離心5-10分鐘，棄去上清液，如果有粘液也一并棄去。沉淀物再加入1ml冷PBS震蕩3-5分鐘，1000-6000r/min離心5-10分鐘，再次棄去上清液。沉淀物中加入適量PBS，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度到含纖毛柱狀上皮細(xì)胞1.0106/ml。3.2 細(xì)胞片制備 微量加樣器吸取上述纖毛柱狀上皮細(xì)胞懸液20ul，點于預(yù)先用4丙酮浸泡過的載玻片上。室溫下空氣干燥后4丙酮浸泡固定10分鐘。3.3 免疫熒光染色 用Chemicon直接免疫熒光試劑盒對所有標(biāo)本進行直接免疫熒光檢測。篩查試劑中含有7種混合單克隆抗體,即腺病毒（ADV）、流感病毒A(IFVA)、B型(IFVB)、副流感病毒1、2、3型(PIV1、2、3)及呼吸道合胞病毒(RSV)單克隆抗體。當(dāng)篩查試驗為陽性時,再用單一特異性單克隆抗體對標(biāo)本進行鑒定檢測。按試劑盒說明一滴混合單克隆抗體或單一單克隆抗體置于標(biāo)本上,37 孵育，篩查為15分鐘，鑒定為30分鐘后,用PBS 洗片3次，每次3-5分鐘，風(fēng)干后封片。封片劑由試劑盒提供。在熒光顯微鏡下觀察。所有標(biāo)本均涂兩張載玻片，一張上面涂一個樣點用于篩查,另一張載玻片上面涂七個樣點，如篩查為陽性,則用涂有七個樣點的載玻片進行鑒定實驗。 3.4 陽性結(jié)果判定及對照設(shè)定 熒光顯微鏡下讀片，放大倍數(shù)為200倍。如果樣點中含有=20個細(xì)胞,則認(rèn)為此片是可以評價的。篩查實驗陽性：在熒光顯微鏡200倍視野下有=2個柱狀纖毛細(xì)胞呈明亮黃綠色熒光即為篩查實驗陽性，否則為陰性。鑒定實驗陽性：在熒光顯微鏡下呼吸道合胞病毒及副流感病毒顯示細(xì)胞漿染色,流感病毒及腺病毒為核染色或細(xì)胞漿內(nèi)染色，否則為陰性。由試劑盒提供陽性及陰性對照片作對照。4.數(shù)據(jù)處理 采用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。 結(jié)果1.呼吸道病毒種類分布 399例入選病人中病毒檢測陽性者54例，男27例，女27例，病毒感染率13.53。其中腺病毒感染5例（1.25），呼吸道合胞病毒感染29例（7.27），流感病毒A型感染27例（6.77），流感病毒B型感染2例（0.50），副流感病毒1型感染13例（3.26），副流感病毒2型感染2例（0.50），副流感病毒3型感染17例（4.26），混合感染22例（5.51）。2.病毒檢出率與年齡的關(guān)系 表1 呼吸道病毒檢出率與年齡的關(guān)系年齡組 例數(shù) 檢出數(shù) 檢出率（） ADV RSV IFVA IFVB PIV1 PIV2 PIV3 混合感染16-23 22 3 13.64 1 2 2 0 0 0 0 124-31 19 2 10.53 0 2 1 0 1 0 1 232-39 27 2 7.41 0 2 0 0 1 0 0 140-47 45 3 6.67 0 1 1 0 0 0 2 148-55 52 7 13.46 1 4 5 0 1 0 1 356-63 96 12 12.50 2 5 7 0 3 0 2 464-71 70 16 22.86 1 8 8 0 5 0 7 771-79 48 4 8.33 0 2 0 0 0 1 1 080-87 20 5 25.00 0 3 3 2 2 1 3 33.呼吸道病毒種類的季節(jié)分布表2 呼吸道病毒的年份、季節(jié)分布季節(jié) 例數(shù) 檢出數(shù) 檢出率（） ADV RSV IFVA IFVB PIV1 PIV2 PIV3 混合感染07春季 33 2 6.06 0 2 1 0 0 0 0 107夏季 91 20 21.98 0 10 11 0 5 0 2 707秋季 99 11 11.11 2 6 4 0 3 1 3 307冬季 73 8 10.96 1 5 5 0 2 0 4 508春季 93 13 13.98 2 6 6 2 3 1 8 608夏季 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 04. 不同疾病的病毒檢出情況表3 幾種常見疾病的病毒檢出情況常見疾病 例數(shù) 檢出數(shù) 檢出率（） ADV RSV IFVA IFVB PIV1 PIV2 PIV3 混合上呼吸道感染 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0肺炎 117 12 10.26 1 7 7 1 4 0 5 5支氣管炎 38 5 13.16 0 5 1 0 2 0 1 2支氣管擴張 35 3 8.57 1 1 2 0 0 0 1 1哮喘 13 2 15.38 1 0 2 0 0 0 1 1COPD 60 10 16.67 1 4 4 1 0 2 2 25. 混合感染檢出情況表4 七種病毒的混合感染情況例 數(shù) ADV RSV IFVA IFVB PIV1 PIV2 PIV3單獨感染 1 14 9 0 2 1 5混合感染 4 15 18 2 11 1 12總 數(shù) 5 29 27 2 13 2 17 討論 直接免疫熒光技術(shù)檢測病毒的抗原快速而準(zhǔn)確，與間接免疫熒光相比，減少了非特異性反應(yīng)而提高了特異性。Chemicon呼吸道病毒的診斷方法經(jīng)過WHO3個參考中心審評，結(jié)果可靠。 本文采用直接免疫熒光法檢測痰標(biāo)本中的病毒抗原，399例病人中，病毒檢出率為13.53，已有報道RSVIgM抗體的測定結(jié)果多在8.1-46.2，雖然方法不同，但本次結(jié)果與該報道接近，且本次研究檢測痰標(biāo)本，易被患者接受。在所檢測的呼吸道病毒中，首位病毒為呼吸道合胞病毒和流感病毒A型，分別占總陽性例數(shù)的53.70和50，其次為副流感病毒3型、副流感病毒1型、腺病毒、流感病毒B型和副流感病毒2型。根據(jù)結(jié)果數(shù)據(jù)，病毒感染主要集中在48-87歲年齡階段。將年齡進一步劃分為四個組（歲）：16-31、32-47、48-63、64-87，各組病毒檢出率分別為12.20、6.94、12.84、18.12，可見，64-87歲年齡組相對于其他年齡組更易受病毒感染，而32-47歲相對不易受病毒感染，可能與相應(yīng)年齡階段的免疫功能狀態(tài)等因素有關(guān)。呼吸道合胞病毒，流感病毒A型感染在各個年齡組檢出率中均位于前列，是成人呼吸道感染的主要病毒病原。呼吸道病毒感染有一定的季節(jié)性，文獻報道以冬春季為最多見。本研究顯示各個季節(jié)均有病毒檢出，病毒檢出率冬春季低于夏秋季，主要原因是研究組沒有收集到2007年3月、2008年2月的痰標(biāo)本，結(jié)果統(tǒng)計時缺少這兩個月份的數(shù)據(jù)，于是最后結(jié)果與文獻報道結(jié)果相反。從表3可以了解到除了上呼吸道感染沒有檢出病毒外，其余常見疾病均有病毒檢出，其中以COPD檢出率最高，為16.67，其次是哮喘，為15.38。呼吸道合胞病毒、流感病毒A型、副流感病毒3型是肺炎、COPD的重要病原，在肺炎中，副流感病毒1型也不容忽視，而在COPD中，副流感病毒2型也很重要。支氣管炎中主要檢出了呼吸道合胞病毒、副流感病毒1型。哮喘中未檢出呼吸道合胞病毒， 流感病毒A型起了重要作用。另外，流感病毒A型在支氣管擴張中檢出率也列在首位。腺病毒在肺炎、支氣管擴張、哮喘、COPD中均有檢出。本次檢測到混合感染22例，占總陽性例數(shù)的40.74，提示混合感染率高是呼吸道病毒感染的一個特點，臨床工作者應(yīng)予以高度重視?；旌细腥局幸粤鞲胁《続型和呼吸道合胞病毒最常見，副流感病毒3型、1型僅次之，其中兩種病毒感染有10例，三種以上病毒感染12例，多重混合感染占較大比重。從單個病毒來分析，流感病毒B型混合感染與總數(shù)比為2/2，副流感病毒1型為11/13，腺病毒為4/5，副流感病毒3型為12/17，流感病毒A型為18/27，呼吸道合胞病毒為15/29，副流感病毒2型為1/2，這七種病毒參與混合感染的比重都很大。成人呼吸道病毒感染的檢測近年來越來越受到人們的重視，APAAP堿性磷酸酶標(biāo)記、免疫熒光、PCR、IgM-ELISA等檢測方法的出現(xiàn)，使呼吸道病毒的準(zhǔn)確、快速檢測成為了可能。呼吸道病毒的檢