PCR(級(jí)研究生).ppt

1,PolymeraseChainReaction（PCR),聚合酶鏈反應(yīng),Departmentofbiochemistryandmolecularbiology,DNA，生命的藍(lán)圖,引物酶,引物酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶,故事發(fā)生在1983年的春夏之交,Mullis開車的時(shí)候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對(duì)面開來的車象是DNA聚合酶，面對(duì)面地合成著DNA，,Mullis的第一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn),1983年9月中旬。Mullis在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶后在37一直保溫。結(jié)果第二天在瓊脂糖電泳上沒有看到任何條帶。于是他認(rèn)識(shí)到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標(biāo)記的PCR條帶。,KaryB.Mullis,1989年美國Science雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。,由一對(duì)引物介導(dǎo),通過溫度的調(diào)節(jié)，使雙鏈DNA變性為單鏈DNA、單鏈DNA與引物復(fù)性（退火）成為引物-DNA單鏈復(fù)合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶使引物延伸而成為雙鏈DNA（引物的延伸）；這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程，就是一個(gè)PCR循環(huán)；一般通過2030個(gè)循環(huán)之后，就可獲得大量（106倍）的要擴(kuò)增的DNA片段。又稱為無細(xì)胞分子克隆技術(shù)、基因擴(kuò)增技術(shù)或DNA擴(kuò)增技術(shù)。Pg水平至ng水平。,第一節(jié)PCR基本原理,一、PCR的基本原理,DNA體外的快速擴(kuò)增技術(shù),模板DNA,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn),引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn),引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn),第1輪結(jié)束,第2輪開始,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn),Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn),第2輪結(jié)束,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn),模板DNA,第1輪擴(kuò)增,第2輪擴(kuò)增,第3輪擴(kuò)增,第4輪擴(kuò)增,第5輪擴(kuò)增,第6輪擴(kuò)增,理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù),20,第二節(jié)、PCR的過程,（一）DNA模板的解鏈（變性）9095，30s理論上，在90左右能使DNA雙鏈之間的所有氫鍵鏈斷開，完全分離為單鏈；且在中性pH情況下，DNA的完整性仍能很好保存。,（二）DNA單鏈與引物的退火（復(fù)性）5565,3045s引物與模板單鏈特異性結(jié)合（較高的溫度）；不希望兩條互補(bǔ)的模板單鏈結(jié)合在一起（DNA引物的量大大超過模板的量，競爭性結(jié)合：引物+模板幾率DNA自身復(fù)性幾率）;,（三）引物的延伸（新鏈DNA的合成）7075，3060s（2kb)首次循環(huán)：引物從3端開始延伸，延伸片段的5端為人工合成引物是特定的，3端沒有固定的終止點(diǎn)，長短不一。第二個(gè)循環(huán)：引物與新鏈結(jié)合，由于后者5端序列是固定的末端，意味著5端的序列就成為此次延伸片段3端的終止點(diǎn)。N個(gè)循環(huán)后：由于多數(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物受到所加引物5端的限定，產(chǎn)物的序列是介于兩種引物5端之間的區(qū)域。引物本身也是新生DNA鏈的一部分。,SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC*,A,C,G,-T,PolymeraseChainReaction-PCR,SpecificshortDNAprimerannealstostrandtobecopied,5,3,SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC*,A,C,G,T,-T,PolymeraseChainReaction-PCR,5,3,SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC*,A,C,G,T,-T,A,PolymeraseChainReaction-PCR,5,3,SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC*,A,C,G,T,-T,A,C,PolymeraseChainReaction-PCR,5,3,SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC*,A,C,G,T,-T,A,C,G,PolymeraseChainReaction-PCR,5,3,SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC*,A,C,G,T,-T,A,C,G,T,PolymeraseChainReaction-PCR,5,3,SynthesisbyDNApolymerase-ATGCATGCATGC*,A,C,G,T,-T,A,C,G,T,A,PolymeraseChainReaction-PCR,5,3,高度的特異性：引物的限定，高溫?cái)U(kuò)增。高度的敏感性：微量樣品（單拷貝基因、單個(gè)細(xì)胞、一根頭發(fā)等），高效性（X106）。操作簡便快速，易于自動(dòng)化、程序化，方法穩(wěn)定。對(duì)標(biāo)本的純度要求底：純化或粗制的，新鮮或陳舊的，各種細(xì)胞，體液，完整的或降解的DNA。,PCR技術(shù)的特點(diǎn),特異性強(qiáng),PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；堿基配對(duì)原則；TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；靶基因的特異性與保守性。,靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg)量級(jí)的起始待測模板擴(kuò)增到微克(g)水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。,簡便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在24小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。,對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測。,PCR反應(yīng),第三節(jié)、PCR擴(kuò)增的基本方法,（一）PCR反應(yīng)體系1.儀器臺(tái)式微量離心機(jī)基因擴(kuò)增儀微量塑料離心管：0.5ml或1.5ml（經(jīng)高壓滅菌）微量加樣器（pipetman）：20P、200P、1000P，電泳儀及電泳槽、紫外攝影裝置、乳膠或塑料手套、Tip若干,PCR,Agarosegelelectrophoresis,Thefinalproduct,UVvisualisation,3-4hours,2.試劑與試樣：一般選用50100l體積，模板核酸（template如：人基因組DNA0.1g)擴(kuò)增引物（primer一對(duì),各0.21mol/L）TaqDNA聚合酶（2.5U）dNTP（四種：各20200mol/L)標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液：10Xbuffer（KCl、Tris-HCl、MgCl2、BSA或DDT）無菌雙蒸水或三蒸水石蠟油或礦物油:3050ul（封閉、防止高溫時(shí)液體的揮發(fā)）,2.PCR反應(yīng)試劑,（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。,（2）引物濃度0.2-1mol/L濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。（3）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。,（4）dNTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。,（5）Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。,PCR反應(yīng)體系,1、10PCRbuffer10l2、dNTPmix各200mol/L3、引物11mol/L4、引物21mol/L5、DNA模板50ng-1g6、Taq酶2U7、加雙蒸水至總體積為100l,（二）常規(guī)PCR的反應(yīng)條件預(yù)變性：94300s（高溫起動(dòng):充分變性，防止非特異性擴(kuò)增）變性：90-95，30s-60s退火：55-6530s-45s延伸：70-7230-60s（5ng溴化乙錠太多，凝膠染色過深，核酸電泳帶看不清時(shí)，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察,酶切分析,根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶進(jìn)行酶切酶切產(chǎn)物電泳分離后，獲得符合理論的片段此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究,PCR-RFLP,分子雜交,檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)檢測PCR產(chǎn)物堿基突變的有效方法主要的雜交Southern印跡雜交斑點(diǎn)雜交,Southern印跡雜交：,在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈并作標(biāo)記（探針）與PCR產(chǎn)物雜交此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產(chǎn)物的靈敏度。,斑點(diǎn)雜交：,將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼龍膜薄膜上寡核苷酸探針雜交觀察有無著色斑點(diǎn)主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析,RDB檢測-地中海貧血突變基因,-29（AG）-28（AG）17（AT，AAGTAG）E（CD26GAGAAG）IVS-I-1（GT）IVS-I-5（GC）27-28（+C）41-42（-CTTT）43（GT）71-72（+A或+T）654（CT）,微孔板夾心雜交法,通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域特異性雜交，使PCR產(chǎn)物間接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的檢測探針與產(chǎn)物的另一區(qū)域特異性雜交，漂洗后顯色即可判斷結(jié)果該法使用了兩個(gè)雜交過程來檢測一個(gè)產(chǎn)物，其特異性較一次雜交的檢測法高,Principle,：NOS（11014/cm2）N-羥化琥珀酰亞胺酯,Principle,-CCCCCC,CaptureProbe:,：NH2,DetectionProbe:,：Biotin,：NH2標(biāo)記的探針,：Biotin標(biāo)記的探針,Avidin-HRP顯色系統(tǒng),：NOS基團(tuán),Principle,PCR-ELISA法：,本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測5端修飾后仍可進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增特異靶序列，因此，可以通過修飾其中一個(gè)引物的5端使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定的功能基團(tuán)，而通過另一引物5端的修飾使產(chǎn)物便于檢測,Sequence,ThespecificmethodshouldbeROBUSTRe-optimiseforeachsetofprimers,第四節(jié)PCR的優(yōu)化OPTIMISEPCRCONDITIONS,X,OptimisingthePCRReaction,Startingnucleicacid-DNA/RNATissue,cells,blood,hairroot,saliva,semenThermo-stableDNApolymeraseOligonucleotidesprimersTheconcentrationofMg2+inthereactionTheannealingtemperature,（一）DNA聚合酶(最關(guān)鍵因素之一)1、Taq-DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性及最適延伸溫度在7080具有最高聚合活性，高溫時(shí)仍比較穩(wěn)定。所以7080為其最適延伸溫度，則退火和延伸反應(yīng)溫度可提高，限制了非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)，增加了PCR的特異性。,2、Taq-DNA聚合酶的功能有53聚合酶活性有53外切酶活性無35外切酶活性Taq-DNA聚合酶TaqDNA酶的聚合出錯(cuò)率較高（2.1X10-4），然而通過優(yōu)化反應(yīng)條件，可使Taq酶的聚合出錯(cuò)率降低到原來的1/3。若要細(xì)胞克隆PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，進(jìn)行表達(dá)，擴(kuò)增后必須測序證實(shí)才可使用。,3、激活劑與抑制劑Taq-DNA聚合酶：其活性需要Mg2+。Mg2+的精確濃度主要取決dNTP濃度Mg2+濃度過高導(dǎo)致非特異擴(kuò)增。一般常用1.5mmol/L,4、其他耐熱DNA聚合酶TthDNA聚合酶（Thermusthermophilus）：在較高的溫度下仍具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，因此能很好地克服RNA鏈中普遍存在二級(jí)結(jié)構(gòu)的難題。VentDNA聚合酶：具有校讀功能，具有相對(duì)較好的高保真性。SacDNA聚合酶：FDDNA聚合酶：,（二）引物（寡核苷酸引物）引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。引物的作用：決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性與長度，決定PCR反應(yīng)的成敗。,PCR引物的設(shè)計(jì)一般原則,引物長度一般以1830bp為宜，過短則降低特異性，過長則會(huì)引起引物間的退火而影響有效擴(kuò)增，同時(shí)也增加引物合成的成本。引物間退火溫度相差不要超過5。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免序列內(nèi)有較長的回文結(jié)構(gòu)，使引物自身不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。G/C和A/T堿基均勻分布，G+C含量在4060%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。,Avoidrepeatsequences,5,5,3,3,notargetPCRproduct,PCR,hairpinloopformation,5-NNNNNNNNNNNGCATGC-35-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3,5-NNNNNNNNNNNGCA3-CGT,5,3,要避免兩個(gè)引物間特別是3末端堿基序列互補(bǔ)以及同一引物自身3末端堿基序列互補(bǔ)的，使它們不能形成引物二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu)。引物3末端堿基一般應(yīng)與模板DNA嚴(yán)格配對(duì)，并且3末端為G、C或T時(shí)引發(fā)效率較高。引物5末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無關(guān)的序列(如限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列、ATG起始密碼子或啟動(dòng)子序列等)，便于克隆和表達(dá)，但其保護(hù)堿基有一定的要求。引物的堿基順序不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性。,Avoidrepeatsequences,5,5,3,3,5,5,3,3,primerdimer,PCR,3repeat,5-NNNNNNNNNNNNNTATA-35-NNNNNNNNNNNNNTATA-3,5-NNNNNNNNTATA-33-ATATNNNNNNNN-5,Avoidrepeatsequences,5,5,3,3,noextension,PCR,5repeat,5-TATANNNNNNNNNNNNN-35-TATANNNNNNNNNNNNN-3,5-TATANNNNNNNN-33-NNNNNNNNATAT-5,5,5,3,3,其他：簡并引物：多種寡核苷酸組成的混合物，彼此之間僅有一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的差異。嵌套引物（巢式PCR）：使DNA序列得到有效的選擇性擴(kuò)增。,86,NestedPCR:toincreasespecificity,Firstroundprimers,FirstroundPCR,Secondroundprimers,SecondroundPCR,Geneofinterest,（三）模板,模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。,PCR模板制備與純化,上述粗樣品含有大量的PCR反應(yīng)抑制物質(zhì)，因此如何去除這些種類繁多的抑制劑或者添加必要的PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑顯得十分重要。,PCR模板制備與純化,從各種粗樣品中去除PCR反應(yīng)抑制劑的程序不盡相同，但常用的手段包括：,（四）脫氧三磷酸核苷酸（dNTPs）,(五）Mg2+Taq酶活性所必需，游離的,Mg2+的標(biāo)準(zhǔn)使用范圍：0.5-10mM,特異性的改進(jìn)：降低Mg2+濃度，但要注意過低的Mg2+濃度又會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量。,有效性的改進(jìn)：提高M(jìn)g2+濃度，但過量Mg2+將導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增,Mg2+的濃度影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性、引物退火、引物二聚體的形成、熔點(diǎn)溫度、酶的活性和準(zhǔn)確性。因此，PCR反應(yīng)系統(tǒng)的主要優(yōu)化參數(shù)是Mg2+的濃度。,(六）PCR的熱循環(huán)計(jì)劃,PCR反應(yīng)條件的選擇,PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟（DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸）而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至4060，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后升溫至7075，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。,退火雜交溫度和時(shí)間,退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素,特異性的改進(jìn)：提高退火溫度（比建議退火溫度提高2-5）；減少退火時(shí)間。過長的退火時(shí)間在正常情況下并不能提高產(chǎn)量，只會(huì)增加非特異性引物雜交的可能性。,退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有模板的長度。,OptimisingtheAnnealingTemperature,Primershaveacalculatedannealingtemperature(e.g.54C)TemperaturemustbeconfirmedpracticallyTemperaturestepsof2CaboveandbelowUsegradientcycler,循環(huán)次數(shù),決定PCR擴(kuò)增程度主要取決于模板DNA的濃度選在2540次之間,影響的主要因素包括,擴(kuò)增底物（引物和dNTPs）有效濃度的下降,非特異性產(chǎn)物或引物二聚體對(duì)反應(yīng)試劑的競爭作用,反應(yīng)試劑的穩(wěn)定性,擴(kuò)增產(chǎn)物抑制作用,高濃度產(chǎn)物的退活作用以及不完全變性,第五節(jié)PCR中應(yīng)注意的事項(xiàng),（一）防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作（二）設(shè)立對(duì)照：陽性對(duì)照：陽性模板陰性對(duì)照：陰性模板,第六節(jié)PCR技術(shù)類型,反向PCR錨定PCR不對(duì)稱PCR原位PCRRT-PCR重組PCR差異顯示PCR免疫PCR實(shí)時(shí)定量PCR多重PCR,1)反向PCR(reversePCR),是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增?？蓪?duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,連接酶,2）不對(duì)稱PCR目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,關(guān)鍵是限制性引物的絕對(duì)量。用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究,高濃度引物,低濃度引物,3）RTPCR:是以反轉(zhuǎn)錄的cDNA作模板所進(jìn)行的PCR反應(yīng),用于測定基因表達(dá)的強(qiáng)度和鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變,呈現(xiàn)mRNA多態(tài)性,克隆mRNA的5和3末端序列,以及從非常少量的mRNA樣品構(gòu)建大容量的cDNA文庫。,標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR程序包括：,mRNA的分離,cDNA反應(yīng)的引物退火,mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,cDNA的PCR擴(kuò)增,引物選擇有三種戰(zhàn)略：,基因特異性引物化，最精確靈敏,寡聚dT引物化,隨機(jī)六聚體引物化,RDDP（反轉(zhuǎn)錄酶）引物、4種dNTP,RNase（核酸酶H活性),DDDP（DNA聚合酶活性）4種dNTP,RNA-DNA雜化分子,雙鏈DNA（cDNA第二鏈）,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,原位PCR（1990）,以組織固定處理細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA為靶序列，進(jìn)行PCR反應(yīng)，不必分離模板DNA或RNA,探針原位雜交,蛋白酶處理,多重PCR（MultiPCR）,加入多對(duì)引物，對(duì)同一模板的若干區(qū)域進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增。適用于繪制真核生物龐大基因或基因組中的缺失圖譜，如分子病的臨床輔助診斷。,P1,P2,P3,P4,P1,P2,P3,P4,正常人擴(kuò)增物,病人擴(kuò)增物,多對(duì)引物的組合必須滿足二個(gè)條件：將反應(yīng)條件較為接近的引物組合在一起，以使反應(yīng)條件盡量適合所有被擴(kuò)增片段；同一反應(yīng)內(nèi)各擴(kuò)增片段的大小應(yīng)不同，以便檢測時(shí)能通過電泳將各片段分離開。,錨定PCR（AnchoredPCR）,AAAAA3,3GGGGGGGG,錨定引物,錨定PCR又稱為cDNA末端快速擴(kuò)增PCR，主要用于5端序列未知的cDNA的擴(kuò)增和克隆。,5,5,5CCCCCCCC,5CCCCCCCC,5,特異性引物,免疫PCR,免疫PCR：結(jié)合了PCR擴(kuò)增體系和以免疫反應(yīng)原理為基礎(chǔ)的技術(shù)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異鑒定和定量分析的反應(yīng)。（一）寡核苷酸探針檢測系統(tǒng)（二）RNA探針-抗體捕獲系統(tǒng),寡核苷酸探針檢測系統(tǒng),此種系統(tǒng)十分靈敏，它能檢測微板中約10pg的生物素化PCR產(chǎn)物，并且適合應(yīng)用于任何靶序列。,RNA探針-抗體捕獲系統(tǒng),PCR-RFLP：根據(jù)突變序列是否位于限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)內(nèi)而設(shè)計(jì)的對(duì)PCR產(chǎn)物作限制性片段長度多態(tài)性分析的技術(shù)。RFLP：在同種生物不同個(gè)體出現(xiàn)不同長度限制性片段類型的現(xiàn)象。,PCR-限制片段長度多態(tài)性,114,PCRmutagenesis(誘變),PCRcanbeusedtointroducedeletionandpointmutations,TwoseparatePCRreactionsareperformed.OnePCRamplifyingthe5